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矮牵牛组织培养体系的建立和ACO基因cDNA的克隆

作　者: 王红波
导　师: 金晓玲
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 矮牵牛 ACC氧化酶 cDNA 组织培养
分类号: S681.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 56次
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内容摘要

矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)花大色艳,花色丰富,广泛应用于花坛布置,景点摆设,窗台点缀,家庭装饰中,深受各国人民喜爱。在我国,随着人们生活水平的提高,对矮牵牛需求量日益增加。矮牵牛是一个杂交种,通过播种繁殖,发芽率很低,且不易保持亲本优良性状。矮牵牛和其他鲜切花一样,随着花朵的开放而迅速衰老,如何延缓花卉的衰老,延长花卉的观赏期已成为近年来专家们研究的主要课题之本研究通过克隆矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段,拟构建其RNAi表达载体,转入到矮牵牛愈伤组织中,通过组织培养再生体系,获得完整的再生植株。本研究以矮牵牛子叶为材料,筛选出了矮牵牛组织培养各阶段的适宜培养基,成功地获得了矮牵牛组织培养再生植株,建立了矮牵牛组织培养植株再生体系；以矮牵牛衰老花瓣为材料,提取了花瓣组织总RNA,通过特异引物RT-PCR,克隆到矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段,为进一步研究奠定了基础,本研究取得的主要成果如下：1.建立了矮牵牛组织培养再生体系(1)矮牵牛种子消毒本研究采用了二次化学试剂消毒法,75%乙醇和0.1%升汞组合使用,这两种试剂最适消毒消毒时间分别为30s与8min;(2)矮牵牛子叶诱导愈伤组织发生和增殖的最适培养基都为MS+1.Omg/L 6-BA +0.5mg/L NAA;(3)矮牵牛子叶愈伤组织诱导不定芽发生的最适培养基为MS+0.5mg/L 6-BA +0.2mg/L NAA;(4)不定芽增殖和生根的最适培养基都为1/2MS;(5)矮牵牛苗移栽最适基质为泥炭土：珍珠岩=1：1,移栽存活率可达66.7%;(6)矮牵牛愈伤组织Hyg抗性筛选最适浓度为lOmg/L。2.建立了适合矮牵牛衰老花瓣总RNA提取的改良Trizol试剂法在传统Trizol试剂法基础上,对其进行改良。结果表明,改良的Trizol试剂法能有效去除矮牵牛衰老花瓣中色素等物质,28S和18SrRNA条带清晰可见,亮度比在1.0-2.0之间,OD260/OD280平均值为1.75,OD260/OD230平均值为1.91。3.矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段的获得以矮牵牛衰老花瓣为材料,提取矮牵牛衰老花瓣总RNA；经RT反转录合成了第一链cDNA;根据ACC氧化酶的保守序列,设计合成了一对特异引物；经PCR扩增和克隆,得到矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA特异片段；在NCBI网站上进行Blast比较,该片段具有高度保守性,与矮牵牛ACC氧化酶基因家族同源性最高达到100%,最低也超过80%,将该片段的互补序列编码的173个氨基酸序列在NCBI网站上进行Blast比较,结果发现,该片段互补序列编码的氨基酸序列与显示的100条ACC氧化酶氨基酸序列同源性为100%的有98个,99%的有1个,91%的有1个。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略词  8-13
绪言  13-27
  1 矮牵牛及衰老生理  13-15
    1.1 矮牵牛  13-14
    1.2 乙烯与矮牵牛花器官衰老的关系  14-15
      1.2.1 植物中乙烯生物合成途径  14
      1.2.2 植物中乙烯生物合成调节  14-15
      1.2.3 乙烯与植物切花衰老生理  15
  2 ACC氧化酶基因工程研究进展  15-17
    2.1 ACC氧化酶  15-16
    2.2 ACC氧化酶基因表达  16
    2.3 ACC氧化酶基因工程研究进展  16-17
  3 RNAi技术的研究  17-18
    3.1 RNAi的概念与特点  17
    3.2 RNAi的作用机制  17-18
    3.3 RNAi技术在植物中的应用  18
  4 矮牵牛组织培养研究进展  18-24
    4.1 矮牵牛外植体选取  18-19
    4.2 矮牵牛培养基选取  19-20
    4.3 培养条件  20-21
    4.4 矮牵牛组织培养激素选取及不同激素组合与比例  21-23
      4.4.1 矮牵牛组织培养激素选取  21
      4.4.2 矮牵牛组织培养不同激素组合与比例  21-23
    4.5 矮牵牛组培苗移栽  23-24
  5 本课题研究的目的与意义、主要研究内容和技术路线  24-27
    5.1 目的与意义  24
    5.2 主要研究内容  24-25
    5.3 主要技术路线  25-27
      5.3.1 组织培养技术路线  25-26
      5.3.2 矮牵牛ACO基因cDNA克隆技术路线  26-27
第1章矮牵牛组织培养体系的建立  27-41
  1 材料与方法  27-32
    1.1 材料与试剂  27
    1.2 方法  27-32
      1.2.1 外植体消毒  27-28
      1.2.2 初代培养  28-29
      1.2.3 愈伤组织增殖培养  29
      1.2.4 愈伤组织诱导芽的分化  29-30
      1.2.5 不定芽的增殖培养  30
      1.2.6 不定芽诱导生根  30-31
      1.2.7 炼苗与移栽  31
      1.2.8 矮牵牛愈伤组织对潮霉素(Hyg)浓度的敏感性实验  31-32
      1.2.9 培养基和培养条件  32
  2 结果与分析  32-36
    2.1 种子灭菌对发芽的影响  32
    2.2 初代培养愈伤组织的发生  32-33
    2.3 愈伤组织继代培养  33
    2.4 不定芽的诱导  33-35
    2.5 不定芽的增殖培养  35
    2.6 不定芽诱导根的分化  35
    2.7 炼苗与移栽  35-36
    2.8 矮牵牛愈伤组织对潮霉素浓度(Hyg)的敏感性实验  36
  3 讨论  36-41
    3.1 种子灭菌  36-37
    3.2 植物生长调节剂  37-38
    3.3 褐化问题  38-41
第2章矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆  41-55
  1 材料与方法  41-47
    1.1 供试材料  41-42
      1.1.1 植物材料  41
      1.1.2 菌种和质粒  41
      1.1.3 主要仪器  41-42
      1.1.4 主要试剂  42
    1.2 方法  42-47
      1.2.1 矮牵牛衰老花瓣总RNA提取  42-43
      1.2.2 总RNA检测  43
      1.2.3 RT-PCR  43-45
      1.2.4 PCR产物的克隆  45-46
      1.2.5 重组质粒的筛选与鉴定  46-47
      1.2.6 测序与生物信息学分析  47
  2 结果与分析  47-52
    2.1 矮牵牛RNA的提取  47-48
      2.1.1 用不同方法提取的总RNA质量  47-48
      2.1.2 用不同方法提取的总RNA纯度和含量  48
    2.2 矮牵牛总RNA的RT-PCR及特异性条带的获得  48-49
    2.3 重组质粒的鉴定  49-51
      2.3.1 菌落PCR鉴定重组质粒  49-50
      2.3.2 重组质粒双酶切鉴定  50-51
    2.4 阳性重组质粒测序及同源性分析  51-52
  3 讨论  52-55
    3.1 矮牵牛衰老花瓣总RNA提取方法  52-53
    3.2 矮牵牛ACC氧化酶基因保守片段扩增和克隆  53-55
结论  55-57
  1 矮牵牛组织培养再生体系  55
  2 矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆  55-57
    2.1 建立了适合矮牵牛衰老花瓣总RNA提取的改良Trizol试剂法  55-56
    2.2 矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段的获得  56-57
本研究主要创新点  57
对下一步工作建议  57-59
参考文献  59-69
附录A  69-71
附录B  71-73
附录C  73-75
致谢  75

矮牵牛组织培养体系的建立和ACO基因cDNA的克隆

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