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黄檗（Phellodendron amurense）丛枝菌根真菌鉴定及菌群结构分析

作　者: 接伟光
导　师: 蔡柏岩
学　校: 黑龙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 黄檗丛枝菌根真菌鉴定变性梯度凝胶电泳菌群结构分析
分类号: S718.81
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 347次
引　用: 5次
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内容摘要

黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)属芸香科阔叶乔木,是我国东北阔叶红松林的重要伴生树种,也是东北著名的三大硬阔之一,为珍贵的药用植物和用材树种。由于不合理的药材资源采收和过度采伐,黄檗这一野生资源已处于濒危状态。丛枝菌根(arbuscular mycohizal, AM)真菌是自然界中普遍存在的一种寡营养活体微生物,能与绝大多数陆生植物根系形成共生体。AM真菌能够提高植物对营养元素的吸收,促进植物生长,改善植物对干旱及毒性污染的耐受性,增强植物的抗病性等。目前,关于黄檗AM真菌的研究仍处于起步阶段,而黄檗AM真菌的鉴定及菌群结构分析国内外尚无人问津,我们开展本项研究,拟采用分子生物学方法鉴定和分析黄檗AM真菌及菌群结构,因此,本项研究不仅对丰富和发展群落生态学具有重要的理论意义,而且对于收集、保护及利用AM真菌微生物资源,为黄檗菌根功能菌群的研究奠定了基础。从东北林业大学林场采集黄檗根系及根际土壤,采用碱解离-酸性品红染色法对黄檗根系进行染色,湿筛倾析-蔗糖离心法分离黄檗根际土壤AM真菌孢子。采用形态学和分子生物学方法对分离得到的AM真菌孢子进行分类鉴定,并应用Nested-PCR技术检测根际土壤AM真菌侵染黄檗根系情况。依据AM真菌孢子形态特征及25S rDNA D1/D2区域序列分析鉴定出黄檗根际土壤中存在4种AM真菌:根内球囊霉(Glomus intraradices),摩西球囊霉(Glomus mosseae),美丽盾孢囊霉(Scutellospora calospora)和变形球囊霉(Glomus versiforme),而应用Nested-PCR技术从黄檗根内只检测到了G. intraradices,G. mosseae和Scu. calospora,表明G. versiforme未侵染黄檗根系。同时,采用Nested-PCR技术扩增黄檗菌根及根际土壤AM真菌18S rDNA NS31/Glol区域,利用该产物优化AM真菌DGGE条件,并结合测序、系统发育分析及DGGE图谱分析技术对黄檗AM真菌菌群结构进行分析。结果表明,Nested-PCR技术具有较高的灵敏性,可有效的从微量DNA中扩增出约230bp的目的片段;AM真菌最佳DGGE条件为:凝胶变性梯度范围30%-60%,纯化后的PCR产物作为DGGE上样样品,丙烯酰胺浓度8.0%,电泳电压130V,电泳时间8h,电泳温度60℃;DGGE条带测序及图谱分析表明,2种样品具有不同的DGGE指纹图谱特征,DGGE带谱在条带的数量、亮度、优势度等方面均存在较大差异;全部序列可分为3类菌群,即球囊霉属、盾孢囊霉属和植物病原微生物,其中Glomus sp. (EF177624)和Glomus sp. (DQ085205)分别为黄檗根系和根际土壤样品中最具优势的AM真菌。

全文目录

中文摘要  2-4
Abstract  4-10
第1章绪论  10-25
  1.1 菌根概述  10-11
  1.2 丛枝菌根真菌系统分类  11-13
  1.3 丛枝菌根的生理生态功能  13-16
    1.3.1 促进寄主植物对磷素的吸收利用  13-14
    1.3.2 促进寄主植物对氮素的吸收利用  14
    1.3.3 促进寄主植物对其它营养元素的吸收利用  14-15
    1.3.4 刺激宿主植物生长  15
    1.3.5 增强宿主植物的抗逆性  15
    1.3.6 提高宿主植物的抗病性  15-16
  1.4 丛枝菌根真菌的鉴定方法  16-18
    1.4.1 形态学方法  16
    1.4.2 组织化学方法  16-17
    1.4.3 生态学方法  17
    1.4.4 分子生物学方法  17-18
  1.5 丛枝菌根真菌菌群结构研究方法  18-23
    1.5.1 传统形态学方法  18
    1.5.2 生物标记法  18-19
    1.5.3 分子生物学方法  19-23
  1.6 本研究的目的及意义  23-25
第2章材料与方法  25-50
  2.1 试验材料  25-32
    2.1.1 供试材料  25
    2.1.2 供试菌种及质粒  25
    2.1.3 扩增引物  25-26
    2.1.4 主要生化及分子生物学试剂  26-30
    2.1.5 培养基及试剂盒  30-31
    2.1.6 主要仪器设备  31-32
  2.2 黄檗丛枝菌根真菌鉴定  32-40
    2.2.1 根系的碱解离－酸性品红染色方法  32-33
    2.2.2 根际土壤AM 真菌孢子分离  33-34
    2.2.3 AM 真菌形态学鉴定  34
    2.2.4 AM 真菌单孢25S rDNA D1/D2 区序列分析  34-40
    2.2.5 AM 真菌种特异性引物的设计及其侵染根检测  40
  2.3 菌群结构分析  40-50
    2.3.1 根际土壤DNA 的提取  40-41
    2.3.2 Nested-PCR 扩增AM 真菌18S rDNA N531/G101 区  41-44
    2.3.3 DGGE 凝胶的制备  44-45
    2.3.4 变性梯度凝胶电泳  45-46
    2.3.5 银染  46-47
    2.3.6 DGGE 条件优化  47
    2.3.7 DGGE 条带的序列分析  47-49
    2.3.8 DGGE 图谱分析  49-50
第3章结果与分析  50-74
  3.1 黄檗菌根发育状况  50
  3.2 黄檗根际土壤AM 真菌的鉴定  50-58
    3.2.1 AM 真菌孢子形态特征  50-52
    3.2.2 AM 真菌25S rDNA D1/D2 区序列分析  52-58
  3.3 黄檗菌根内AM 真菌的分子检测  58-59
    3.3.1 AM 真菌种特异性引物的设计  58
    3.3.2 根样DNA 的提取及AM 真菌侵染根系检测  58-59
  3.4 菌群结构分析  59-74
    3.4.1 根际土壤DNA 的提取  59-60
    3.4.2 Nested-PCR  60-61
    3.4.3 DGGE 条件优化  61-63
    3.4.4 DGGE 条带的序列分析  63-70
    3.4.5 DGGE 图谱分析  70-74
第4章讨论  74-83
  4.1 课题背景  74
  4.2 AM 真菌孢子分离及DNA 提取  74-75
    4.2.1 AM 真菌孢子分离  74-75
    4.2.2 AM 真菌单孢及根样DNA 提取  75
  4.3 黄檗根际土壤AM 真菌鉴定  75-76
  4.4 根际土壤总DNA 的提取  76-77
  4.5 变性梯度凝胶电泳技术  77-83
    4.5.1 PCR-DGGE 分析  77-79
    4.5.2 DGGE 凝胶的制备  79-80
    4.5.3 DGGE 条件优化及银染  80-81
    4.5.4 DGGE 条带序列分析  81
    4.5.5 DGGE 图谱分析  81-83
第5章结论  83-84
参考文献  84-95
致谢  95-96
攻读学位期间发表的学术论文  96-97

黄檗（Phellodendron amurense）丛枝菌根真菌鉴定及菌群结构分析

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