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细菌产胆固醇氧化酶与红色素的相关性研究

作　者: 霍惠芝
导　师: 王武
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 胆固醇氧化酶(COD) 红色素复合诱变偶联效应类胡罗卜素
分类号: TS201.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本文以产胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6)红色短杆菌DGCCN-R为研究对象,以提高胆固醇氧化酶(COD)生成水平为目的,研究了这株红色菌株产COD和产色素的关系,试图利用这种相关性,创立一种理性、简易、可行的COD高产株筛子。遗传稳定性实验观察表明,红色菌株DGCCN-R转接8代之后,仍然保持高产COD和产红色素的性质,未观察到自发的回复突变,说明其产酶和产红色素具有遗传稳定性。经生理生化测试和16S rDNA测序鉴定,我们暂定此菌株名为红色短杆菌。研究了红色菌株DGCCN-R产COD与红色素,以及红色素与发酵液中底物胆固醇、胆固醇代谢产物胆甾-4-烯-3-酮的关系。发现菌株DGCCN-R产COD与产色素成正偶联关系。以超声波联合亚硝基胍的复合诱变方法,对红色菌株DGCCN-R进行了诱变处理,得到两株突变株DGCCN-W和DGCCN-P,DGCCN-W为白色菌落,DGCCN-P为淡粉色菌落。这两株变异株在菌落颜色变淡的同时,产酶能力也相应下降,说明出发菌株DGCCN-R本身产COD和产红色素存在着偶联关系。通过对培养基中主要碳、氮源,培养温度、通气量,以及培养基中添加金属离子的优化,分析了产酶和色素色价的关系。结果表明这些因素对菌株产酶和产色素的影响基本一致,从发酵水平说明菌株DGCCN-R产酶和产色素成正偶联关系。对菌种所产色素进行了分离提取,分析了色素与产酶在代谢上的关系。HPLC、UV、MS等仪器分析结果以及抑制剂实验表明,菌种产生的红色素为一类类胡罗卜素。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章绪论  8-16
  1.1 胆固醇氧化酶的来源与应用前景  8-10
    1.1.1 胆固醇氧化酶的来源与分布  8-9
    1.1.2 胆固醇氧化酶的应用前景  9-10
  1.2 红色细菌产生胆固醇氧化酶的概况  10-11
  1.3 细菌红色素的生物合成与分离提取  11-14
    1.3.1 红色素的生物合成  11-12
    1.3.2 影响红色素生物合成的因素  12-13
    1.3.3 红色素的分离提取方法  13-14
  1.4 本课题研究的立足点和主要内容  14-16
第二章红色菌株产COD 和红色素相关性的初步确定  16-28
  2.1 材料  16-17
    2.1.1 菌种  16
    2.1.2 主要实验仪器  16-17
    2.1.3 主要试剂  17
    2.1.4 培养基  17
    2.1.5 胆固醇氧化酶检测液  17
  2.2 实验方法  17-19
    2.2.1 培养条件  17
    2.2.2 胆固醇氧化酶活的测定  17
    2.2.3 残留胆固醇测定  17-18
    2.2.4 16S rDNA 提取测定  18
    2.2.5 红色物质粗提取与全波长扫描分析  18
    2.2.6 出发菌株处理  18
    2.2.7 超声波结合亚硝基胍诱变处理  18-19
  2.3 结果与讨论  19-26
    2.3.1 红色菌株遗传稳定性实验  19
    2.3.2 红色菌株生理生化及分子鉴定  19-21
    2.3.3 红色素粗提取后进行全波长扫描  21
    2.3.4 红色菌株发酵不同时间产COD 与红色素的关系  21-24
    2.3.5 诱变剂量的确定  24
    2.3.6 复合诱变法验证COD 与红色素的偶连关系  24-26
  2.4 本章小结  26-28
第三章发酵条件对COD 和红色素生成的影响  28-36
  3.1 材料  28
    3.1.1 菌种  28
    3.1.2 主要仪器  28
    3.1.3 主要试剂  28
    3.1.4 培养基  28
  3.2 实验方法  28-29
    3.2.1 培养条件  28
    3.2.2 酶活测定方法  28
    3.2.3 红色素粗提取和检测方法  28-29
    3.2.4 色价相对单位定义  29
  3.3 结果与讨论  29-35
    3.3.1 培养基中碳源、氮源和金属离子对产酶和色素色价的影响  29-32
    3.3.2 摇瓶装液量和培养温度对产酶和色素色价的影响  32-33
    3.3.3 4℃和光照条件下发酵液中色素稳定性和酶活稳定性  33-35
  3.4 本章小结  35-36
第四章红色素分析及其与COD 生成的关联性探讨  36-44
  4.1 材料  36
    4.1.1 菌种  36
    4.1.2 主要实验仪器  36
    4.1.3 主要试剂  36
    4.1.4 培养基  36
  4.2 实验方法  36-37
    4.2.1 培养条件  36
    4.2.2 红色素提取方法  36-37
    4.2.3 红色素的分离纯化  37
    4.2.4 红色素种类鉴定  37
    4.2.5 红色素的紫外可见光谱测定  37
    4.2.6 红色素的HPLC 检测条件  37
    4.2.7 红色素的质谱分析条件  37
    4.2.8 抑制剂吡氟酰草胺作用方法  37
  4.3 结果与讨论  37-43
    4.3.1 硫酸显色反应及溶解性结果  37-38
    4.3.2 红色素稳定性分析  38-39
    4.3.3 红色素紫外可见光谱结果  39-40
    4.3.4 红色素的HPLC 图谱  40-41
    4.3.5 红色素的质谱图谱  41
    4.3.6 抑制剂对色素生成的影响  41-43
  4.4 本章小结  43-44
论文结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-50
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  50

细菌产胆固醇氧化酶与红色素的相关性研究

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