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猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究

作　者: 刘源
导　师: 陈焕春；贝为成
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统 narQ/narP 基因缺失生物学特性差异表达
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的高度接触传染性呼吸道疾病(Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP),重创了全球畜牧业。胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子众多,各种毒力因子在APP致病过程中的角色及其相互作用的关系形成了错综复杂的网络。病原菌在感染过程中通过双组分调控系统(Two-Component Regulatory System, TCS)密切感受各种条件下因素的变化,从而调节多种基因的表达来适应新的宿主微环境以完成其致病过程。经全基因组序列分析发现胸膜肺炎放线杆菌血清3型JL03菌株存在五对TCSs,即arcA/arcB、cpxA/cpxR、narQ/narP、phoB/phoR、ygiY/ygiX。硝酸盐是很多细菌在厌氧生长条件下最偏爱的电子受体。narQ/narP是E.coli以及巴斯德科属的细菌感应硝酸盐信号的TCS,与许多菌属的narX/narL具有很高同源性,在许多病原菌中都存在这对双组分调控系统。在E.coli中narQ/narP与narX/narL具有相互调节作用。作为一种兼性厌氧菌,通过比较基因组分析发现,所有已测序的APP菌株中均无narX/narL存在。那么,narQ/narP是通过怎样的调控机制来影响APP的功能?鉴于上述背景,在本实验室已经完成的国内流行的APP血清3型JL03菌株全基因组测序基础上,以国内流行的强毒株APP血清1型SLW01菌株为亲本,开展了narQ/narP双组分调控系统可能的调控机制的研究。本研究首先使用两步交换同源重组的方法,利用SacB蔗糖负向筛选结合氯霉素正向筛选作为标记基因构建了SLW01的narQ、narP单基因和narQ/narP双基因缺失突变株,研究narQ/narP敲除后细菌的遗传稳定性、生长特性、溶血性、外观形态、毒力等发生的变化,并运用表达谱芯片和荧光定量PCR,筛选突变株与亲本株的差异表达基因,分析narQ/narP可能参与调控的基因,为APP致病机理的深入研究奠定前期基础,并为APP毒力因子相互调控网络及药物靶标设计等提供理论基础。主要研究内容包括：1.JL03中narQ, narP生物信息学分析参照NCBI中APP血清3型JL03菌株生物学信息,对JL03中双组分调控系统narQ/narP在基因组上的位置,转录方向,碱基组成,G+C含量及保守性区域进行分析,绘制进化树。分析表明,双组分在基因组上的位置相距较远,二者转录方向相反,narP位于正链,narQ位于负链,二者在细菌种属进化中较为保守,与曼氏杆菌属相应蛋白的亲缘关系最近,二者分别符合HK和RR的一般结构特点。2.ΔnarP/ΔnarQ/ΔnarPQ基因缺失菌株的构建及鉴定从SLW01中扩增narP和narQDNA的上下游片段,将得到的上下游片段依次连接到重组转移质粒pEMOC2,构建重组转移质粒pEMAnarP和重组转移质粒pEMAnarQ。ΔnarP的构建是以转化了重组转移质粒pEMΔnarP的E.coliβ2155为供体菌,APP血清1型菌株SLW01为受体菌进行接合转移,采用基于SacB蔗糖负向筛选结合两步交换同源重组的方法构建的。同样,ΔnarQ是以转化了重组转移质粒pEMΔnarQ的E.coliβ2155为供体菌,APP血清1型菌株SLW01为受体菌采取同样的接合转移的方法进行。在ΔnarP的基础上,用转化了质粒pEMΔnarQ的E.coliβ2155作为供体菌,ΔnarP作为受体菌进行接合转移,用同样的方法构建了双基因缺失株ΔnarPQ。通过序列分析,发现目的基因已经缺失；RT-PCR结果显示,突变株中无目的基因转录信号。结果表明缺失株构建成功。3.ΔnarP/ΔnarQ互补菌株(CnarP, CnarQ)的构建及鉴定从SLW01基因组中扩增narP, narQ的DNA,将其连接入E.coli-—胸膜肺炎穿梭质粒pJFF-XN构建重组表达质粒pJFF-narP, pJFF-narQ,将质粒分别电转化入SLW01菌株中,获得ΔnarP、ΔnarQ的互补菌株(CnarP, CnarQ),使用RT-PCR对其进行验证。结果表明互补菌株构建成功。4.反应调控蛋白narP的表达扩增SLW01中narP基因,将其连接入原核表达载体pET-28a构建原核表达质粒pET-narp。将质粒转化入E.coli (BL21)后用IPTG对其诱导表达,SDS-PAGE检测其表达活性。结果IPTG诱导6小时,获得E.coli重组narP蛋白。narP可以稳定表达。5.基因缺失菌株生物学特性的研究将AnarP、ΔnarQ、ΔnarPQ缺失菌株分别在平皿上连续传20代,每代都使用PCR鉴定其遗传稳定性,结果表明,三种缺失株都能够稳定的遗传；将缺失株与亲本株的单菌落接种于9%绵羊血平皿培养23h测定ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarQ的溶血活性,结果显示溶血活性无显著差异；对缺失株和亲本株的生长速率进行比较,绘制ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarPQ生长曲线,分析表明ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarPQ与亲本菌比较,在对数生长期缺失株比亲本株生长稍慢；将缺失株和亲本株在TSA平皿培养7h经固定液固定,用扫描电镜观察其外观形态有无变化,结果表明外观形态无明显差异。本研究测定了APP亲本菌和ΔnarP缺失菌对Balb/C小鼠的LD50,结果显示,与亲本菌SLW01比较,ΔnarP的毒力有所降低,其互补株CnarP与亲本株相比毒力稍有所升高。6.缺失株与亲本株差异表达基因的筛选和功能聚类分析将SLWO1、ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarPQ同时分别在有氧和厌氧条件下培养,利用APP表达谱芯片分析菌株对数期的转录谱,对芯片杂交的原始数据统计分析,找出了缺失株与亲本株有明显差异表达的一些基因。使用荧光定量PCR验证芯片结果的可靠性。进一步对一些基因进行了功能及聚类分析。有氧条件下与SLW01相比,ΔnarP差异表达基因有75个,而ΔnarQ差异表达的基因有31个,以及ΔnarPQ有21个厌氧条件下条件与SLW01相比,ΔnarPQ双基因缺失突变株差异表达基因达84个,ΔnarQ有61个,ΔnarP有22个SLW01在厌氧与有氧培养条件下相比,总有153个基因在转录水平上出现了明显变化。有41个基因上调表达,有112个基因下调表达。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-13
缩略词  13-14
1. 文献综述  14-18
  1.1 胸膜肺炎放线杆菌概述  14-15
    1.1.1 病原学  14
    1.1.2 流行病学  14
    1.1.3 PCP致病机理  14-15
    1.1.4 APP毒力因子研究进展  15
  1.2 细菌双组分调控系统研究概述  15-18
    1.2.1 组分调控系统概述  16
    1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统研究现状  16-18
2. 研究目的和意义  18-19
3. 材料与方法  19-35
  3.1 材料  19-25
  3.2 方法  25-35
    3.2.1 生物信息学相关分析  25
    3.2.2 胸膜肺炎放线杆菌的复苏  25
    3.2.3 DNA的抽提  25
    3.2.4 DNA的回收与纯化  25-26
    3.2.5 RNA的抽提  26
    3.2.6 DnaseI消化RNA中残余的DNA  26-27
    3.2.7 RNA反转录  27
    3.2.8 质粒的转化  27-28
    3.2.9 质粒的抽提  28
    3.2.10 SDS-PAGE电泳  28
    3.2.11 SLW01菌株narP及narQ DNA上下游片段的扩增与鉴定  28-30
    3.2.12 pEMAnarP,pEMΔnarQ的构建及鉴定  30
    3.2.13 ΔnarP、ΔnarQ、ΔnarPQ的构建及鉴定  30-31
    3.2.14 ΔnarQ/ΔnarP互补菌株(CnarP,CnarQ)的构建及鉴定  31-32
    3.2.15 缺失菌株生物学特性分析  32-33
    3.2.16 反应调控蛋白RR(narP)的表达  33
    3.2.17 基因芯片定制及芯片结果分析相关操作  33-35
4. 结果与分析  35-54
  4.1 JL03中narQ/narP生物信息学相关分析  35-38
    4.1.1 narQ/narP一般特性  35
    4.1.2 narQ/narP进化树绘制  35-37
    4.1.3 narQ/narP保守性区域分析  37-38
  4.2 重组转移质粒pEMΔnarP,pEMΔnarQ的构建和缺失菌株筛选与鉴定  38-41
  4.3 ΔnarQ/ΔnarP互补菌株CnarP,CnarQ的构建和鉴定  41-42
  4.4 突变株生物学特性分析  42-46
    4.4.1 生长速率分析  42-43
    4.4.2 溶血活性分析  43-44
    4.4.3 遗传稳定性分析  44
    4.4.4 突变株外观形态方面的观察  44-45
    4.4.5 SLW01、ΔnarP、CnarP的LD_(50)的测定  45-46
  4.5 反应调控蛋narP的克隆、表达  46
  4.6 基因芯片定制和结果分析  46-54
    4.6.1 RNA质量控制  46
    4.6.2 差异表达基因的筛选  46
    4.6.3 差异表达基因的荧光定量验证  46-48
    4.6.4 差异表达基因功能分析与聚类  48-54
5. 讨论  54-61
  5.1 APP组分调控系统narQ/narP的选择  54
  5.2 突变株构建与筛选  54-55
  5.3 基因芯片RNA提取时机的选择  55
  5.4 有氧条件下缺失株与亲本株(SLW01)基因差异表达变化  55-56
  5.5 厌氧条件下APP缺失株与亲本菌(SLW01)差异表达基因分析  56-57
  5.6 亲本菌(SLW01)厌氧培养条件下差异表达基因变化  57-59
    5.6.1 转录水平上调的基因  57-58
    5.6.2 转录水平下调的基因  58-59
    5.6.3 综合讨论  59
  5.7 展望  59-61
6. 结论  61-62
参考文献  62-67
致谢  67-68
附表  68-84

猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究

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