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黄芪丹参配伍对肥大心肌细胞肌浆网钙转运关键蛋白干预作用研究

作　者: 孙娅楠
导　师: 林谦；农一兵
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 丹参注射液肥大心肌细胞钙调控蛋白黄芪注射液心力衰竭
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各种心血管系统疾病发展的终末阶段。心肌肥厚是心衰主要的代偿机制和重要的病理生理环节。心衰一旦发生,预后极差,纽约心功能Ⅲ、Ⅳ级的患者5年生存率不足50%,尽管随着ACEI和p-受体阻滞剂的应用,其治疗方法已得到改善,但是发病率、病死率仍然很高,早期预防是最佳的干预策略。因此应该重视心衰的早期发病机制。心力衰竭的发生除与心肌数目的减少,心脏收缩时空顺序的紊乱有关外,其病理生理核心在于心肌细胞收缩和舒张功能受损。正常情况下,当心肌细胞受生物电的刺激发生兴奋时,胞膜除极,激活电压依赖性钙通道(L型),细胞外钙离子顺着浓度梯度进入胞内,触发钙依赖性钙释放,大量钙离子经Ryanodine Receptor (RyR)受体由肌浆网迅速进入胞浆,细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)急剧升高,细胞收缩；复极时,肌浆网膜上的钙泵(SERCA2a)在受磷蛋白(PLB)的调节下,将胞浆中的大部分钙离子重新摄入肌浆网中进行贮存；同时细胞膜上的钠-钙交换蛋白(Na+-Ca2+ exchanger, NCX,)也顺电化学梯度将部分钙离子移出胞外,以平衡除极时由L型钙通道进入的钙离子,从而使[Ca2+]i降低,细胞舒张,且保持细胞内外钙离子浓度的稳定,有利于下一个收缩周期的进行。因此,这种在电刺激下由心肌细胞中各种钙调控蛋白的协调作用所产生的胞内钙离子浓度的动态瞬时变化(钙瞬变,calcium transient)是心肌细胞收缩和舒张的分子基础。慢性心力衰竭时,心肌细胞内的钙瞬变发生异常,与正常的心肌相比,其[Ca21i上升速度较慢,幅度较低,且恢复延迟；于是心肌的收缩速度减慢、强度降低和舒张迟缓,出现心功能受损。而这种钙瞬变的异常是由心衰时心肌细胞内各种钙调控蛋白的改变导致的。心肌肌浆网钙转运已被认为是从代偿性心肌肥厚发展为心衰早期而重要的机制之一,并可能是未来干预的靶点,但至今仍没有相应的特异性药物可供临床应用。中医辨证论治在心衰早期干预方面具有一定的优势,临床研究认为气虚、血瘀是引起心衰发生、发展的关键因素。以往实验也提示中药对肌浆网钙转运具有不同的调节作用,益气药黄芪、活血药丹参是治疗心肌肥厚、心衰的常用药,具有确切的临床疗效,在改善气虚血瘀证同时,可以改善心肌肥厚、延缓心衰的进展。但是到目前为止,未见到从肥厚心肌细胞肌浆网钙转运这一重要机制进行的系统研究,缺乏对肥厚心肌细胞钙瞬变影响的报道以及肌浆网钙转运关键蛋白方面进行的系统研究。本课题在大量文献整理、分析及既往研究工作的基础上,在细胞及分子水平,肌心肌细胞肌浆网钙转运机制着手,验证“芪丹参配伍可以通过改善心肌肌浆网钙转运从而预防心肌肥厚向心衰发展”的假说。阐释黄芪、丹参治疗心肌肥厚,预防心衰发生发展的药理学基础。一、黄芪丹参配伍对正常心肌细胞的存活率及对肥大心肌细胞的影响方法：体外原代培养乳鼠心肌细胞,分为对照组(Control, C)、肥大模型组(Model,M)、丹参注射液组(DS)、黄芪注射液组(HQ)、丹参黄芪组(DQ),采用四氮唑盐比色法,观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及不同浓度梯度的黄芪注射液和丹参注射液对心肌细胞存活率的影响,确定最适宜的黄芪注射液和丹参注射液浓度。结果：浓度为10-6·L-1的黄芪注射液和浓度为10-6·L-1的丹参注射液能起到更有益的干预作用；AngⅡ作用24h后细胞活性最强,而药物干预作用不强,48h之后细胞活力下降低于正常培养的心肌细胞,各用药组此时起效可使心肌细胞活力增加,至72h细胞活力继续下降,丹参注射液组治疗作用较黄芪注射液组及联合用药组好。二、肥大心肌细胞钙转运相关蛋白基因表达的变化及黄芪丹参配伍对其调节作用方法：采用RT-PCR法在造模后24h、48h、72h,观察不同时点AngⅡ对钙离子转运关键蛋白SERCA2a, PLB mRNA转录水平的影响。同时观察丹参注射液和黄芪注射液的干预作用。结果：1.24h,与正常组相比模型组SERCA2a、PLB mRNA转录水平,SERCA2a/PLB比率均有所下降,但与正常组相比均无统计学意义(P>0.05)。丹参注射液组可上调PLB mRNA转录水平,下调SERCA2a/PLB比率。黄芪注射液组可上调SERCA2a.PLB mRNA转录水平及SERCA2a/PLB比率。联合用药组则下调SERCA2a, PLB mRNA转录水平、上调SERCA2a/PLB比率。2.48h,与正常组相比模型组SERCA2a, PLB mRNA的转录水平,SERCA2a/PLB比率,仍呈现下降趋势。丹参注射液组上调SERCA2a mRNA转录水平,下调PLB mRNA转录水平,上调SERCA2a/PLB比率至正常水平。黄芪注射液组上调SERCA2a mRNA转录水平、下调PLB mRNA转录水平,显著上调SERCA2a/PLB比率。联合用药组继续下调SERCA2a PLB mRNA转录水平,上调SERCA2a/PLB比率。3.72h,与正常组相比模型组SERCA2a mRNA转录水平下降、PLB mRNA的转录水平下降更为显著,SERCA2a/PLB下降比率有所回升。丹参注射液组上调SERCA2a、PLB mRNA转录水平、SERCA2a/PLB比率。黄芪注射液组上调SERCA2a mRNA转录水平,对PLBmRNA转录水平继续起下调作用,对SERCA2a/PLB比率仍具有显著上升作用,联合用药组升高SERCA2a mRNA转录水平的效果明显,对PLB mRNA转录水平有上调趋势,显著上调SERCA2a/PLB比率。结论：AngⅡ在心肌细胞从肥大走向心衰的过程中可引起心肌细胞存活率的动态变化,影响心肌细胞肌浆网钙转运相关蛋白的mRNA转录水平,从而影响钙瞬变的正常发生。提示AngⅡ能够诱导肌浆网钙摄取关键蛋白转录水平的变化从而导致肌浆网钙转运的障碍,黄芪注射液、丹参注射液可以在不同程度上抑制AngⅡ的上述作用。在慢性心力衰竭中,黄芪注射液、丹参注射液的长疗程干预不但可以保护心脏的整体功能,而且对单个心肌细胞的舒张特性也具有保护作用,可以拮抗心衰时心肌细胞钙瞬变调控蛋白的异常变化。其抗心衰作用可能部分是通过减缓心力衰竭时心肌细胞肌浆网钙调控蛋白mRNA转录水平的变化,从而改善心肌细胞的钙瞬变,致使心肌细胞的收缩特性得到保护。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
英文缩略词表  11-13
上篇文献综述  13-31
  心肌细胞肌浆网钙转运关键蛋白与心力衰竭研究概况  13-31
下篇实验研究  31-71
  黄芪丹参配伍对肥大心肌细胞肌浆网钙转运的干预作用研究  31-71
    前言  31-37
    第一部分黄芪丹参配伍对正常心肌细胞的存活率及对肥大心肌细胞的影响  37-55
      材料与方法  37-40
      结果  40-48
      讨论  48-52
      小结  52-53
      参考文献  53-55
    第二部分肥大心肌细胞钙转运相关蛋白基因表达的变化及黄芪丹参配伍对其调节作用  55-71
      材料与方法  55-59
      结果  59-66
      讨论  66-69
      小结  69-70
      参考文献  70-71
致谢  71-73
个人简历  73-74

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