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中国明对虾Kazal型蛋白酶抑制因子的性质、抑制动力学和在先天免疫中的作用的研究

作　者: 王纵横
导　师: 王金星
学　校: 山东大学
专　业: 动物学
关键词: Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子中国明对虾混合性抑制因子快速紧密结合型抑制因子先天免疫
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子通过限制内外源蛋白酶的活性、抗炎症反应和黏膜上皮的抗菌反应在先天免疫中起着重要的作用。通过对Kazal型抑制因子的研究,可加深对其抑制性质的了解,深入认识其在先天免疫中的功能,还可以开发其药用价值。我们在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的肝胰腺中克隆并鉴定了四个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(FcSPI-1-4)。四个FcSPI的cDNA的开放阅读框(ORFs)长度分别是1389,1236,1080和939bps,演绎的蛋白的氨基酸长度分别是462,411,359和312,形成9,8,7和6个Kazal结构域。对氨基酸的序列分析表明,四个FcSPI的cDNA可能是由同一个转录本经过选择性剪切而来,并且每个cDNA内所有的结构域各不相同。多重序列比对显示,四个FcSPI的Kazal结构域有保守的基序：Cx3Cx6VCGSDGxTYx3CxLx5Cx5ITx6GC。结构域多的分子包含有结构域少的分子的所有结构域。由于,序列保守性较高,很难分别鉴定表达模式,所以我们设计了一对RT-PCR引物,这对引物可以从四个FcSPI的cDNA中克隆到相同的片段以显示四个基因在体内的总共的表达模式。RT-PCR结果说明FcSPI的表达模式受到细菌刺激而上调,但其表达不因病毒的刺激而发生明显变化。根据四个FcSPI成熟肽的cDNA序列,我们构建了四个表达载体FcSPIs／pGEX-4T-1,并在大肠杆菌中分别进行表达。蛋白表达在细菌裂解液的上清中,通过亲和纯化得到较纯的蛋白质。重组蛋白rFcSPI-1的抑制活性受DTT的抑制,而且有着一定的热稳定性。抑制动力学研究表明,重组蛋白rFcSPI-1是一种混合型快速紧密结合抑制因子。rFcSPI-1对枯草蛋白酶A,蛋白酶K和弹性蛋白酶的最大抑制活性大约是与该酶的分子量比分别为1：1,1：2和2：l。在细菌结合实验中,rFcSPI-1可以与两种革兰氏阳性菌和一种革兰氏阴性菌紧密结合,但是并没有抑菌活性。rFcSPI-1能抑制细菌分泌的蛋白酶和对虾免疫相关的天然糜蛋白酶。这表明,FcSPI-1既可以通过抑制细菌蛋白酶参与对虾的先天免疫反应,又可以通过抑制蛋白酶活性参与对虾免疫相关的蛋白酶调控反应。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
符号说明  10-11
第一章综述  11-22
  一.动物的先天免疫  11-12
  二.Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的研究背景  12-22
    1.丝氨酸蛋白酶抑制因子的分类及特点  12-13
    2.Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的特点  13-16
    3.蛋白酶抑制因子的抑制动力学及Kazal抑制因子的抑制类型  16-19
    4.Kazal型抑制因子在免疫反应中的作用  19-21
    5.Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的研究意义和展望  21-22
第二章 FcSPIs的cDNA克隆和性质研究  22-47
  一.引言  22
  二.材料和方法  22-33
    1.实验动物和菌株  22-23
    2.试剂和设备  23-24
    3.实验方法  24-33
      3.1. cDNA克隆  24-26
      3.2. RT-PCR  26-27
      3.3. FcSPIs的重组表达  27-28
        3.3.1. FcSPIs的载体构建  27-28
        3.3.2. 重组蛋白诱导试表达  28
        3.3.3. 重组蛋白大规模表达  28
      3.4. FcSPIs重组蛋白的纯化  28-29
      3.5. 多克隆抗体的制备  29
      3.6. Western blot检测重组蛋白纯度  29-30
      3.7. rFcSPIs的丝氨酸蛋白酶抑制活性  30-31
      3.8. rFcSPI-1的理化性质  31
        3.8.1. 对Dithiothreitol(DTT)的敏感度实验  31
        3.8.2. rFcSPI-1的热稳定性  31
      3.9. rFcSPI-1的抑制动力学  31-32
      3.10. rFcSPI-1在先天免疫中的作用  32-33
        3.10.1. rFcSPI-1的细菌结合活性  32
        3.10.2. rFcSPI-1的抑制细菌分泌蛋白酶和中国明对虾天然糜蛋白酶活性  32-33
  三.实验结果  33-43
    1. cDNA克隆  33-35
    2.序列对比  35
    3.RT-PCR  35-36
    4.重组表达及蛋白纯化  36-38
    5.rFcSPIs的蛋白酶抑制活性  38-39
    6.rFcSPI-1的抑制动力学  39-41
    7.重组蛋白FcSPI-1的理化性质  41-42
    8.rFcSPI-1在先天免疫中的功能  42-43
      8.1. rFcSPI-1的细菌结合活性  42
      8.2. rFcSPI-1的抑制细菌分泌蛋白酶和天然糜蛋白酶的活性  42-43
  四.讨论  43-47
参考文献  47-53
总结与创新点  53-55
致谢  55-56
发表文章  56-57
学位论文评阅及答辩情况表  57

中国明对虾Kazal型蛋白酶抑制因子的性质、抑制动力学和在先天免疫中的作用的研究

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