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MyD88在中国卤虫不同发育时期及在革兰氏菌刺激下的表达模式

作　者: 赵鑫鑫
导　师: 侯林
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 中国卤虫 MyD88基因胚胎发育先天免疫
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

中国卤虫(Artemia sinica)属于节肢动物门(Phylum Arthropoda),甲壳纲(Class Crustacea),鳃足亚纲(Subclass Branchiopoda),无甲目(Order Anostaca),卤虫科(Family Artemiidae),卤虫属(Genus Artemia)。卤虫广泛分布在沿海及内陆高盐水体中,是水产养殖业中的重要饵料生物。由于卤虫发育过程短并可抵抗干燥、高温、高盐等不良环境,使其成为一种重要的实验动物而被广泛研究,特别是作为先天免疫研究的实验材料发挥了重要的作用。无脊椎动物没有特异性免疫,先天免疫是其唯一的防御机制。在其先天免疫反应中,Toll途径在抗真菌及抗革兰氏阳性菌应答诱导抗菌肽表达过程中是必需的,而MyD88是Toll信号途径中的一个关键的转接蛋白。当机体受到感染后Spatzle活化Toll,Toll将信号传给MyD88,再以MyD88为中心引发一系列信号级联反应做出免疫应答反应。此外,在果蝇胚胎发育过程中发现MyD88对果蝇背腹轴的形成有一定的作用。所以对卤虫胚胎发育和免疫机制过程中MyD88基因表达模式的研究有着十分重要的意义。本论文以中国卤虫为实验材料,采用分子生物学技术克隆了中国卤虫MyD88基因部分片段,经Blast比对确定该序列为中国卤虫MyD88基因。采用RACE技术获得了1555bp的中国卤虫MyD88基因的cDNA全序列。对其进行分子生物学分析发现该序列包括一个长度为1182bp的开放阅读框,编码393个氨基酸,蛋白结构及氨基酸序列分析发现其包含MyD88特有的N端死亡结构域,C端含有TIR结构域的bo1、box2基序。经整体免疫组化技术发现中国卤虫MyD88基因表达部位主要集中于头、胸部,推测可能与卤虫免疫因子形成有关。实时定量PCR技术对MyD88在卤虫胚胎发育不同时期表达量进行研究,发现MyD88在中国卤虫胚胎发育各时期呈组成性表达,并且呈现先高后低的趋势,在0h和5h表达量最高,其他各时期差别不大。推测MyD88可能在卤虫胚胎发育中作为一种母体基因调控免疫相关基因或胚胎发育相关基因的表达。革兰氏阳性菌刺激后,MyD88表达量随着菌浓度的增加而增加。可见其在抵抗革兰氏阳性菌侵染过程中发挥着重要的作用。低浓度的革兰氏阴性菌刺激MyD88表达量未见上升,高浓度的革兰氏阴性菌刺激MyD88表达量上调。可见MyD88在抵抗革兰氏阴性菌感染中也发挥着一定的作用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 前言  9-20
  1.1 卤虫的研究概述  9-12
    1.1.1 卤虫的形态特征  9
    1.1.2 卤虫分类的研究  9-10
    1.1.3 卤虫胚胎发育及生活史  10
    1.1.4 卤虫分布及经济价值  10-12
  1.2 MyD88基因的结构、功能及在免疫过程中的作用  12-17
    1.2.1 免疫系统的概述  12-13
    1.2.2 TLRs的结构和功能研究  13-15
    1.2.3 MyD88的结构和功能  15
    1.2.4 MyD88相关的信号通路  15-17
  1.3 卤虫免疫相关基因研究  17-19
  1.4 本研究的目的和意义  19-20
2 材料与方法  20-32
  2.1 材料  20-23
    2.1.1 卤虫孵化及培养条件  20
    2.1.2 主要试剂  20-23
    2.1.2 仪器与设备  23
  2.2 方法  23-32
    2.2.1 实验器材的处理  23-24
    2.2.2 卤虫各时期总RNA的提取  24
    2.2.3 反转录合成cDNA  24-25
    2.2.4 克隆目的基因并测序  25-28
    2.2.5 RACE技术  28-29
    2.2.6 生物信息学分析  29
    2.2.7 整体免疫组化  29-30
    2.2.8 实时定量PCR  30-32
3 结果  32-44
  3.1 RNA提取质量  32
  3.2 PCR扩增结果及序列分析  32-33
  3.3 RACE技术获得MyD88全序列  33-34
  3.4 MyD88基因信息学分析  34-37
  3.6 MyD88基因在卤虫胚胎发育过程中表达部位  37-39
  3.7 中国卤虫MyD88 Real time PCR  39-44
    3.7.1 Real time PCR引物分析  39-40
    3.7.2 MyD88在卤虫胚胎发育各时期的表达模式  40-42
    3.7.3 MyD88在革兰氏菌刺激下的表达模式  42-44
4 讨论  44-48
  4.1 中国卤虫MyD88基因的全长结构  44
  4.2 MyD88在中国卤虫各发育阶段的表达部位  44-45
  4.3 中国卤虫MyD88基因在不同发育阶段的表达模式  45
  4.4 菌刺激胁迫下MyD88的表达模式  45-46
  4.5 实验条件的优化  46-48
    4.5.1 卤虫RNA提取及反转录方法的优化  46
    4.5.2 实时荧光定量PCR的优化  46
    4.5.3 整体免疫组化实验优化  46-48
结论  48-49
参考文献  49-54
攻读硕士期间发表论文情况  54-55
致谢  55

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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