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促神经分化活性化合物筛选方法构建及神经分化与微管蛋白表达关联性研究

作　者: 许敏华
导　师: 楼宜嘉
学　校: 浙江大学
专　业: 药理学
关键词: P19鼠胚癌细胞小鼠胚胎干细胞神经分化黄酮类化合物组合化学微管蛋白
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

第一章:促P19鼠胚癌细胞分化神经元样细胞活性筛选方法构建1.Tubulin alphaⅠ稳定转染P19鼠胚癌（P19 embryonal carcinoma,P19）细胞分化神经元样细胞应用研究目的:建立Tubulin alphaⅠ（Tα1）稳定转染P19细胞系,构建体外经诱导分化为神经元样细胞模型,以用于高效快速筛选化合物促神经分化活性。方法:借助阳离子脂质体转染法,将构建的质粒Tα1-PGL4.17[luc2/Neo]Vector转染至P19细胞中,经G418筛选,阳性克隆传代培养。经转染的P19细胞,当神经分化Neo基因表达启动时,用荧光素酶检测呈荧光,荧光强度与分化神经元样细胞成正比。设计不同浓度RA诱导分化为神经元样细胞适用性试验,并以DMSO作对照。96孔板贴壁2天后用荧光素酶试剂盒分别检测其荧光值,观察该转染细胞是否可用于大量化合物活性筛选。结果:RA组贴壁后分化的表型明显优于DMSO组和空白组,但重复实验数据欠稳定,未转染细胞组荧光值虽正常（为零）;但阳性对照RA组比阴性对照DMSO组和空白对照组都低,且随着贴壁时间增长,荧光值有逐渐降低的趋势。结论:初步建立了Tubulin alphaⅠ稳定转染P19细胞的体系,但在用于化合物诱导分化神经元样细胞活性筛选中,适用性欠理想,亟待建立更优化的评价体系。2.P19细胞FM1-43FX染料荧光染色法评价分化神经元样细胞应用研究目的:探索P19细胞分化为神经元样细胞FM1-43FX染料特异性荧光染色,构建诱导分化为神经元样细胞高效快速筛选化合物模型。方法:根据FM1-43FX染料可结合于细胞膜,通过高K离子诱导神经细胞动作电位,随神经囊泡重摄取过程而进入细胞内,故可特异性针对有囊泡重摄取功能神经细胞进行染色的原理,测得的荧光强度与P19细胞分化神经元样细胞成正比。设RA为阳性对照,DMSO为阴性对照,构建适宜于化合物诱导分化神经元样细胞评价方法。96孔板设6个浓度,贴壁培养2,4,6和8天,分别探索RA在该体系促神经分化的最佳时间和最佳浓度。另在同块板上洗去染料后,以MTT法评价细胞增殖情况,避免因死亡细胞吸附荧光染料所致的假阳性。结果:P19细胞贴壁培养4天开始两组间荧光定量即存在统计学差异,但相差显微镜未显示形态学呈显著轴突形成。贴壁培养6天后,相差显微镜显示RA处理组细胞形成神经元样形态,但FM1-43FX染色荧光成像尚未能充分体现。贴壁培养8天后,不仅荧光定量显著增强,而且相差显微和荧光显微均体现明显的轴突形成,提示适宜于筛选用。MTT结果显示诱导过程中药物均无显著毒性作用,5×10^-7mol/LRA为最佳促神经分化浓度。结论:FM1-43FX荧光染色法可用于神经元样细胞特异性染色。P19细胞贴壁培养8天后所获荧光强度最大,且测得荧光值与神经元样细胞表型高度一致。本研究成功构建高效快速促神经分化初步筛选方法。第二章黄酮类化合物库内小分子促神经分化活性筛选1.P19细胞FM1-43FX荧光染色法评价促神经分化初级筛选目的:采用P19细胞体外定向分化为神经元样细胞荧光染色法技术,结合MTT实验,对黄酮类化合物库内30个小分子进行促神经分化活性评价。方法:黄酮类化合物根据结构分为a、b、c三个系列,每个系列各10个化合物。5×10^-7 mol/L RA为阳性对照,DMSO为阴性对照。P19细胞以1×10⁵ cells/ml的密度加供试化合物悬浮培养4天,悬浮培养液为:90%α-MEM+10%进口胎牛血清,悬浮完毕,收集聚集的拟胚体用0.25%的胰蛋白酶和D-Hanks以1:5的比例在37℃孵箱内消化5min后离心计数,以1×10⁶ cells/ml的密度贴壁培养,培养液为:95%α-MEM+5%胎牛血清,96孔板贴壁培养,每2～3天换一次液。采用FM1-43FX染料荧光染色法测定评价结果。同时结合MTT实验评价细胞增殖情况,避免假阳性。结果:1a、4a、5a、3’a、4’a、5’a、3b、5c等8个化合物呈现促神经分化活性,荧光强度分别具有统计学差异（P＜0.05,P＜0.01）。MTT结果显示8个化合物均未抑制细胞增殖。结论:（1） P19细胞定向分化为神经元样细胞表型和荧光强度具有一致性,该体系可用于促神经元样细胞形成化合物活性筛选。（2） 1a、4a、5a、3’a、4’a、5’a、3b、5c此8个化合物有促P19神经分化活性,且不具有细胞毒性。（3） a’系列化合物呈现8位取代构效关系,随着8位取代侧链的增长,荧光值增大,提示8位取代碳原子数与促神经细胞形成活性呈一定的正比关系。2.胚胎干细胞神经形成表型筛选目的:利用促胚胎干（Embryonic stem,ES）细胞定向分化神经元样细胞4-/4+法,进一步确定初筛活性化合物的促神经分化作用,以期发现促神经再生先导化合物。方法:经P19细胞初筛呈阳性结果的8个化合物,按照4-/4+法进一步评价促小鼠ES细胞定向分化神经元样细胞作用。相差显微镜初步评价具有轴突和胞体的神经元,以轴突为胞体3-5倍长初步定为神经元表型形成。再以免疫荧光成像分析β-TubulinⅢ阳性表达细胞确认,流式细胞术定量比较分化率。结果:相差显微镜和免疫荧光成像分析,经P19细胞初筛所获的8个活性化合物均可促进ES细胞β-TubulinⅢ阳性表达,其中4a化合物效果最佳;初筛结果中不具有促神经分化活性的两个化合物1c、5’c则几乎无β-TubulinⅢ阳性表达。ES细胞免疫荧光成像的结果与P19细胞筛选结果基本吻合。流式细胞术定量比较结果显示:阴性对照组DMSO阳染细胞略微偏高,但与阳性对照RA组相比有一定的差异,供试药物组结果与免疫荧光成像的结果基本吻合。结论:（1）经ES细胞次级筛选,4a、5c两个化合物有较好的促神经分化作用,而5’c则几乎不具有此作用。（2）该化合物构效关系分析显示:1、甲氧基的神经诱导活性强于羟基;2、4’位取代会减弱其神经诱导活性。第三章黄酮类化合物促神经元样细胞分化与微管蛋白表达关联性研究目的:探索化合物4a是否经由上调三个神经元呈特征性表达的细胞骨架蛋白:微管相关蛋白2（MAP2）、神经丝蛋白（NEFM）、α-TubulinⅢ而促ES细胞定向分化神经元样细胞,由此获得可能存在的信号通路/分子事件。方法:采用经典的拟配体4-/4+法模拟体内胚胎发育状态,形成拟配体,进而贴壁向神经元样细胞分化。利用western blot法评价神经元呈特征性表达的三个细胞骨架蛋白:微管相关蛋白2（MAP2）、神经丝蛋白（NEFM）和微管蛋白（β-TubulinⅢ）的表达水平,作为药物促ES细胞定向分化神经元指标。结果:阴性对照组DMSO和阳性对照组RA,三个骨架蛋白的表达均存在一定的时间发育依赖性,随着贴壁培养时间的增长,表达上调;而对于化合物4a,NEFM和β-TubulinⅢ两个骨架蛋白的表达也存在一定的时间发育依赖性,但是MAP2蛋白表达呈一定的下降趋势。结论:化合物4a可能是经由上调NEFM和β-TubulinⅢ这两个神经元呈特征性表达的细胞骨架蛋白而促ES细胞定向分化神经元样细胞的。

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致谢  4-5
基金资助情况  5-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-14
中英文对照表  14-17
第一章促P19鼠胚癌细胞分化神经元样细胞活性筛选方法构建  17-37
  1 引言  17-18
  2 实验仪器与材料  18-19
  3 实验方法一  19-24
    3.1 实验结果  23
    3.2 讨论  23-24
    3.3 结论  24
  4 实验方法二  24-37
    4.1 实验结果  28-34
    4.2 讨论  34-36
    4.3 结论  36-37
第二章黄酮类化合物库内小分子促神经分化活性筛选  37-52
  1 引言  37-38
  2 实验仪器与材料  38
  3 实验方法  38-42
  4 实验结果  42-49
  5 讨论  49-51
  6 结论  51-52
第三章黄酮类化合物促神经元样细胞分化与微管蛋白表达关联性  52-62
  1 引言  52-53
  2 实验仪器与材料  53-55
  3 实验方法  55-57
  4 实验结果  57-58
  5 讨论  58-60
  6 结论  60-61
  7 论文创新点  61-62
参考文献  62-65
综述干细胞研究进展  65-88
作者简介及硕士在读期间所获科研成果情况  88

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