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一株绿粘帚霉对植物病原菌的拮抗作用及抗菌活性成分分离鉴定

作　者: 朱薇薇
导　师: 樊美珍；胡丰林
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 绿粘帚霉 抗真菌活性 液体发酵 抑菌机理 盆栽试验 结构鉴定
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究以安徽农业大学微生物防治省级重点实验室的一株具有较高抑菌活性的绿粘帚霉RCEF4099菌株的次生代谢产物为研究对象,系统研究了RCEF4099菌株发酵液的抗菌活性与抗菌成分。主要内容包括:菌株部分生物学指标测定;抑菌试验;有利于活性成分产生的发酵条件优化;菌株抑菌机理初探;室内盆栽试验;活性物质的分离与结构鉴定。对RCEF4099菌株的生长速度和几丁质酶活性进行了测定。通过测定菌株RCEF4099的直径,可以看出菌落的生长速度较快,其中第四天的生长速度最快,第五天直径即达到了9cm。共测定8天菌株RCEF4099的几丁质酶活性,几丁质酶在第2天开始表达,第7天达到高峰,之后开始下降。绿粘帚霉菌株RCEF4099分别与辣椒灰霉、小麦赤霉、玉米小斑、小麦纹枯、棉花枯萎、苹果炭疽、油菜菌核、水稻纹枯8种植物病原真菌进行对峙试验和杯碟法抑菌试验。综合两种抑菌实验方法,得出绿粘帚霉RCEF4099对辣椒灰霉的抑菌效果最好。本研究以抑菌活性为指标(抑菌圈大小),比较不同的营养性因素包括碳氮源、无机盐及不同的非营养因素包括种龄、接种量、装液量、摇瓶的转速对活性物质产生的影响,最终筛选出RCEF4099菌株产生抗菌活性物质的最佳发酵条件如下:RCEF4099在装液量40/ 100 ml (V/ V) ,接种量10% (V/ V) ,培养时间5d,摇床转速160 r/ min时活性最强;发酵培养基的成分为:4%葡萄糖、0 .5%白砂糖、1.5%干酵母、0.02%K2HPO4。对RCEF4099菌株发酵液的稳定性测定结果表明菌株转接6代之前,活性稳定,第10代的抑菌圈直径仅比出发菌株减少了1.7mm。RCEF4099菌株发酵液有较好的热稳定性和酸碱稳定性。通过粘帚霉发酵液对辣椒灰霉的孢子和菌丝生长形态两方面的影响来探寻绿色粘帚霉RCEF4099的抑菌机理。RCEF4099菌株的代谢产物对辣椒灰霉病菌孢子的萌发有极强的抑制作用,经处理后孢子萌发畸形的比率较高,对病原菌的菌丝也同样有致畸作用。室内盆栽实验结果表明: RCEF4099菌株发酵液对辣椒灰霉病有较高的保护和治疗作用,预防作用和治疗作用都在76%以上。通过比较不同提取方法的处理及相关理化试验,确立了活性物质的最佳提取工艺为:发酵液50℃浓缩至原体积的1/5,加入3倍体积95%乙醇(乙醇终浓度为75%)醇沉两次,弃沉淀并脱醇后,以丙酮为萃取试剂,按2:1的体积比分两次萃取,取丙酮相,浓缩至干,即得到活性物质的粗提品。本试验采用高效液相色谱法分析粗提物,同时收集流分进行活性测定,确定活性组分的大致部位,进而对活性流份进行HPLC-MS分析。初步可以推断出发酵液的活性组分是1,3,5,7-环辛四烯,分子量为104,分子式为C8H8。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-9
1 文献综述  9-17
2 引言  17-19
3 材料与方法  19-32
  3.1 材料  19-22
  3.2 方法  22-32
4 结果与分析  32-59
  4.1 绿粘帚霉菌株RCEF4099生长速度的测定  32
  4.2 绿粘帚霉菌株RCEF4099 几丁质霉活性的测定  32-33
  4.3 绿色粘帚霉RCEF4099 抗真菌实验  33-37
    4.3.1 对峙实验  33-36
    4.3.2 杯碟法  36-37
  4.4 绿色粘帚霉RCEF4099发酵条件的研究  37-46
    4.4.1 营养性因素对菌株RCEF4099 抑菌活性的影响  37-43
    4.4.2 非营养性因素对RCEF4099菌株抗菌活性的影响  43-46
  4.5 绿色粘帚霉RCEF4099 发酵液稳定性的测定  46-48
    4.5.1 RCEF4099 菌株发酵液抗菌效果的传代稳定性测定  46
    4.5.2 RCEF4099菌株发酵液抗菌效果的热稳定性  46-47
    4.5.3 RCEF4099菌株发酵液抗菌效果的酸碱稳定性  47-48
  4.6 绿色粘帚霉 RCEF4099 抑菌机理初探  48-49
    4.6.1 粘帚霉发酵液对孢子的影响  48-49
    4.6.2 粘帚霉发酵液对病原菌菌丝生长形态的影响  49
  4.7 室内盆栽试验  49-50
  4.8 代谢活性产物的提取工艺  50-53
    4.8.1 菌丝体的去除  50
    4.8.2 大分子杂质的去除  50-51
    4.8.3 最佳萃取试剂的选择  51
    4.8.4 最佳萃取体积比的确定  51-52
    4.8.5 最佳萃取次数的确定  52-53
    4.8.6 活性物质的最佳提取方案流程  53
  4.9 绿色粘帚霉 RCEF4099 抑菌活性组分的分离与结构鉴定  53-59
    4.9.1 活性组分的初步分离  53-54
    4.9.2 活性组分的进一步分离  54-55
    4.9.3 活性化合物的分析  55-59
讨论  59-63
结论  63-65
参考文献  65-72
致谢  72-73
作者简介  73
发表的学术论文目录  73

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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