【目的】:利用可降解性的聚对二氧环己酮编制出力学性能优良的人工血管支架,组织工程学方法构建三层结构的可降解性小口径人工血管,对其进行生物力学研究和体内降解实验;分离和培养犬骨髓CD34+细胞,研究其生物学特性并种植于人工血管内表面,对体外构建可降解性小口径组织工程血管模型的方法进行研究。【方法】:筛选出具有抗张强度高、力学性能优良的聚对二氧环己酮(PDS)可吸收缝线进行编织,测定和分析PDS缝合线的生物力学性能,并通过对不同的编织工艺加以研究、比较,选择最为合适的编织方法和工艺编织血管支架。以可降解的聚对二氧环己酮(PDS)缝合线编织成的网管状织物作为血管支架,模仿天然血管的三层结构,内层共混硫酸软骨素-胶原,外层包被小肠黏膜下层(SIS),检测血管支架的生物力学性能(爆破压力、抗拉伸能力、顺应性等),并与正常生理血管进行比较。将支架材料植入比格犬背部脊柱两侧肌肉内,于2、4、8、12、24周取出,行组织学和透视电镜观察,观察其理化性质变化及组织反应情况。抽取犬骨髓,Ficoll液分离单个核细胞,免疫磁珠分离CD34+细胞,流式细胞仪检测细胞纯度,DMEM液培养,内皮细胞生长因子(VEGF)诱导分化,行CD31、vWF(Ⅷ因子)免疫荧光、免疫细胞化学和Dil-Ac-LDL吸收实验鉴定细胞特性。将内皮细胞种植于人工血管支架内表面,扫描电镜观察内皮细胞在人工血管腔面的分布和生长情况。【结果】:(1)聚对二氧环己酮单丝强度高,断裂强度和断裂伸长率两个指标PDS均大于直径相同的聚丙烯纤维。PDS纤维柔顺性好,编织性能好,采用规则编织结构可编织出强度高弹性好、孔隙率大、光滑平整的网状血管支架。(2)所制备的复合型人工血管的爆破压为(43.5±8.3)kPa,断裂强度为(19.10±1.56)N,应变率为(42.88±3.16)%,径向顺应性为(5.96±0.87)%/100mmHg。(3)植入体内2-4周时,SIS与胶原层清晰可见,炎细胞浸润较多,扫描电镜见胶原海绵网孔结构破坏融合,形成板层结构,海绵结构基本保持。12周时,自身纤维结缔组织完全取代胶原蛋白海绵材料,纤维组织广泛长入网材孔间隙内,炎性细胞减少,PDS发生了部分降解。24周时,支架材料完全吸收,被新生纤维组织填充,炎细胞和和异物巨噬细胞少见。降解过程中未见材料周围组织变性、坏死或肉芽肿异常增生现象。(4)经流式细胞仪测定,免疫磁珠方法分离的细胞中CD34+细胞含量为79.27±5.85%。经免疫磁珠分离获得的骨髓CD34+细胞在倒置显微镜下为折光性强的圆形细胞,大小均一,24h后观察开始出现贴壁细胞,呈圆形,随后逐渐伸出伪足,倒置显微镜下刚贴壁的细胞呈典型的“鹅卵石”状,细胞形态逐渐演变成梭型,两周后细胞基本铺满培养瓶底面。(5)免疫荧光、免疫细胞化学结果示CD31和vWF表达均为阳性,Dil-Ac-LDL吸收功能实验阳性,证明成功诱导分化为内皮细胞。(6)扫描电镜观察内皮细胞在人工血管内表面的种植情况,可见大量内皮细胞粘附于人工血管内表面,细胞形态伸展,连续性较好,有伪足伸出并长入血管内表面微孔内。【结论】:(1)聚对二氧环己酮力学性能优良,可作为可降解性小血管支架的编织材料。采用65度编织工艺角和规则编织结构的编织工艺,可制备出力学性能良好,弹性回复率佳的小口径网管作为组织工程血管支架。(2)所制备的小口径人工血管支架的生物力学性能良好。(3)所制备的小口径人工血管支架生物相容性好,组织反应轻,降解时间合适。(4)免疫磁珠方法可分离得到高纯度的骨髓CD34+细胞,且CD34+细胞经VEGF诱导后可定向分化为内皮细胞。(5)骨髓CD34+细胞经培养诱导后可种植于人工血管内表面,内皮化效果理想。
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