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表达绿色荧光蛋白的猪伪狂犬病病毒与猪细小病毒VP2基因的重组病毒的构建

作　者: 杨慧敏
导　师: 李文刚
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 细小病毒伪狂犬病病毒 VP2基因转移载体重组病毒
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 101次
引　用: 3次
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内容摘要

猪细小病毒(PPV)与伪狂犬病毒(PRV)是引起猪繁殖障碍的两个主要病原。PPV和PRV引起的疾病在我国有很高的感染率和发病率,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。传统的常规疫苗对防制PPV和PRV的感染有一定的效果,但是存在不可避免的缺陷,为了更好的控制PPV和PRV感染,研制更加安全有效的PPV-PRV二价基因工程疫苗是解决这一问题的最好途径。伪狂犬病病毒基因组为一双链、线状DNA,在长约150kb的基因组上存在许多与病毒复制无关的非必需基因,这些基因可供外源基因的插入,而使之能成为活载体疫苗。根据AnaI.Ranz等报道的PPV NADL-2株病毒基因组序列设计了一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,分别在引物的上、下游5’端引入了BamHI酶切位点,以含PPV NADL-2株全部序列的GH质粒为模板,扩增了完整的PPV VP2基因和部分VP1基因,将扩增的目的基因VP2克隆入PMD18-T载体内,构建了重组质粒。经PCR鉴定证明插入片段是VP2基因,并将重组质粒命名为PT-GFP。用BamHI酶切扩增的VP2基因和载体PG质粒并回收,将载体PG质粒去磷酸化后与目的片段VP2基因连接,构建了重组质粒PG-VP2。通过PCR扩增、酶切、序列测定证明,该转移载体构建成功。经酶切鉴定证明插入片断是VP2基因片断,并证明插入方向正确。利用脂质体介导的方法,将转移载体质粒PG-VP2与PRV基因组DNA共转染PK-15细胞。于荧光显微镜下48小时便能观察到绿色荧光,用吸管将有荧光的病变细胞吸出,经过三次连续传代得到了纯化的重组病毒。并经过PCR和酶切鉴定重组病毒构建成功。为进一步制备抗猪细小病毒的重组伪狂犬病毒活载体疫苗奠定了基础。

全文目录

致谢  4-9
摘要  9-10
第一章文献综述  10-31
  1. 伪狂犬病毒(PRV)研究进展  10-18
    1.1 PRV 的病原学特征  10-13
      1.1.1 PRV 的分类  10
      1.1.2 PRV 基因组结构  10-13
    1.2 伪狂犬病病毒诊断方法研究进展  13-15
      1.2.1 病原学方法  13-14
      1.2.2 血清学方法  14-15
    1.3 PRV 基因工程疫苗研究进展  15-18
      1.3.1 PRV 基因缺失疫苗  15-17
      1.3.2 PRV 活载体疫苗  17-18
  2. 猪细小病毒（PPV）研究进展  18-24
    2.1 PPV 病原学的特征  18-19
    2.2 PPV 的分子生物学研究进展  19-20
      2.2.1 PPV 的基因组结构  19-20
      2.2.2 PPV DNA 的复制特点  20
    2.3 PPV 基因组编码蛋白  20-22
      2.3.1 结构蛋白  20-21
      2.3.2 非结构蛋白  21-22
    2.4 PPV 疫苗研究进展  22-24
      2.4.1 PPV 弱毒疫苗  22
      2.4.2 PPV 灭活疫苗  22-23
      2.4.3 PPV 基因工程疫苗  23-24
  3. 绿色荧光蛋白（GFP）研究进展  24-31
    3.1 GFP 的分子结构  25
    3.2 GFP 的生化性质  25-26
    3.3 影响GFP 表达强度的因素  26
    3.4 GFP 在生物学研究中的应用  26-30
    3.5 展望  30-31
第二章试验研究  31-54
  实验一、表达绿色荧光蛋白的猪伪狂犬病病毒与猪细小病毒VP2基因转移载体的构建  31-46
    引言  31
    1 材料与方法  31-40
      1.1 材料  31-34
      1.2 方法  34-40
        1.2.1 重组质粒PT-VP2的构建  34-36
        1.2.2 PPV VP2基因的扩增与克隆  36-37
        1.2.3 重组质粒PT-VP2的鉴定  37
        1.2.4 含VP2基因转移质粒PG-VP2的的构建  37-38
        1.2.5 PG 质粒的改造  38
        1.2.6 转移载体PG-VP2 的构建  38-40
        1.2.7 序列测定  40
        1.2.8 重组质粒及细菌的保存  40
    2 结果  40-43
      2.1 质粒GH 的酶切鉴定  40-41
      2.2 PPV VP2 PCR 扩增结果与分析  41
      2.3 重组质粒PT-VP2的PCR 鉴定  41-42
      2.4 PG 质粒的酶切鉴定与 PCR 扩增鉴定  42
      2.5 连接质粒PG-VP2 的酶切鉴定  42-43
      2.6 连接质粒PG-VP2 的PCR 鉴定  43
      2.7 序列测定  43
    3 讨论与分析  43-45
      3.1 绿色荧光蛋白基因（GFP）与其他几种报告基因的对比  44
      3.2 抽提与胶回收纯化 DNA 的比较  44
      3.3 关于伪狂犬病病毒转移载体及构建  44-45
      3.4 关于 PRV gG 基因  45
    4 结论  45-46
  实验二、表达绿色荧光蛋白的猪伪狂犬病病毒与猪细小病毒VP2基因重组病毒的构建  46-54
    引言  46
    1 材料与方法  46-50
      1.1 材料  46-47
      1.2 方法  47-50
        1.2.1 细胞的准备  47-48
        1.2.2 PRV 病毒的增殖与收获  48
        1.2.3 病毒DNA 的提取  48
        1.2.4 重组转移载体质粒（PG-VP2）的提取  48-49
        1.2.5 转染用细胞的准备  49
        1.2.6 转移载体质粒（PG-VP2）DNA 与PRV 基因组 DNA 的共转染  49
        1.2.7 重组病毒的筛选与纯化  49-50
    2 结果与分析  50-51
      2. 1 转移质粒 DNA 的提取  50
      2.2 PRV 病毒DNA 的提取  50
      2.3 转移载体质粒与病毒DNA 的共转染  50-51
      2.4 重组病毒的筛选与纯化  51
    3 分析与讨论  51-53
      3.1 关于病毒 DNA 的提取  51
      3.2 关于转移载体质粒DNA 的提取  51
      3.3 转移载体质粒与病毒DNA 共转染效率的优化  51-52
      3.4 关于重组病毒的构建  52-53
    4 小结  53-54
参考文献  54-63
英文摘要  63

表达绿色荧光蛋白的猪伪狂犬病病毒与猪细小病毒VP2基因的重组病毒的构建

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