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鸭瘟病毒部分基因组序列的克隆及重组病毒转移载体的构建

作　者: 陈普成
导　师: 田国彬
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭瘟病毒基因组进化分析转移载体重组病毒
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鸭瘟(Duck plague)又名鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE),由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起,是鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。其特征是流行广泛,传播迅速,发病率和死亡率高,能够造成较大的经济损失,是危害养鸭业的主要疫病之一。鸭瘟病毒的研究起步较晚,其分子生物学方面的研究相对滞后,严重制约了针对病毒基因的功能及病毒在机体细胞、组织中的复制机理、感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面的研究;对鸭瘟病毒的分子生物学特性进行研究将加速其重组活载体疫苗的研制进程。构建基因组文库是开展鸭瘟病毒分子生物学研究的基础,而获得大量的高度纯化鸭瘟病毒基因组DNA是构建鸭瘟病毒基因组文库的首要步骤,本研究首先差速离心收集病毒沉淀,然后用蔗糖密度梯度离心法提纯病毒,利用经典的蛋白酶K、SDS裂解,酚∶氯仿抽提法提取鸭瘟病毒基因组DNA,结果表明此种方法能够获得完整的病毒基因组DNA,且所得DNA在纯度与得率上明显优于其他方法,经脉冲场电泳后发现其大小位于145-194 kb之间,经限制性酶切后脉冲场电泳图谱条带清晰,为鸭瘟病毒基因组文库的构建奠定了坚实的基础。为研究鸭瘟病毒基因组部分未知序列的组成与结构,本研究利用长片段PCR技术扩增了鸭瘟病毒UL区及部分基因组末端的未知序列,对其中的部分序列进行了测序和分析,结果表明这些序列包含五个与单纯疱疹病毒(HSV)同源的基因,即UL41、UL42、US7、US8、US1,序列分析表明这五个基因与疱疹病毒科其它成员的相应基因同源,UL41基因编码宿主关闭蛋白(vhs);UL42基因编码病毒DNA聚合酶持续合成因子;US7、US8基因分别编码病毒gI和gE糖蛋白。首次发现鸭瘟病毒US1基因以双拷贝形式存在。根据ICTV(国际病毒分类委员会)第八次报告,鸭瘟病毒的分类地位仍未确定,本研究利用UL41、UL42、US7及US8四个基因对鸭瘟病毒与а疱疹病毒亚科成员的进化关系进行了分析,UL41基因进化树表明鸭瘟病毒与а疱疹病毒亚科成员进化关系相对较远,属于一个独立分支,而UL42、US7及US8基因的进化树则表明其与马立克病毒、火鸡疱疹病毒的进化关系相近。本研究为鸭瘟病毒的分类提供了一定的参考依据。鸭瘟和禽流感是危害鸭的两个最主要疫病,研制鸭瘟和禽流感双价疫苗具有十分重要的应用价值。本研究依据已测的鸭瘟病毒基因组序列,在四个推测为鸭瘟病毒复制非必需的位点(US2、US10、TK及UL45)构建了重组病毒转移载体,并对转移载体中各标记基因与目的基因表达盒的有效性进行了验证,结果表明其能够在细胞内充分表达,为鸭瘟病毒重组基因工程活载体疫苗的研制奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章绪论  13-21
  1.1 病原及流行病学  13-14
  1.2 鸭瘟病毒分子生物学研究进展  14-19
    1.2.1 鸭瘟病毒基因组特征  14-16
    1.2.2 鸭瘟病毒的分类  16-17
    1.2.3 鸭瘟病毒的主要结构蛋白  17-19
  1.3 α疱疹病毒载体研究进展  19-20
    1.3.1 研究现状  19
    1.3.2 重组α疱疹病毒的构建与应用  19
    1.3.3 鸭瘟病毒载体研究进展  19-20
  1.4 本研究的目的和意义  20-21
第二章鸭瘟病毒基因组脉冲场电泳分析  21-26
  2.1 材料与方法  21-23
    2.1.1 细胞及毒种  21
    2.1.2 主要仪器及试剂  21
    2.1.3 方法  21-23
  2.2 结果  23-24
    2.2.1 鸭瘟病毒基因组限制性酶切图谱  23-24
  2.3 讨论  24-26
    2.3.1 鸭瘟病毒的增殖及提纯方法的比较  24-25
    2.3.2 鸭瘟病毒基因组DNA 提取方法探讨  25
    2.3.3 鸭瘟病毒基因组DNA 限制性酶切分析  25-26
第三章鸭瘟病毒 UL41、UL42 及 U57、U58 基因的克隆及序列分析..  26-37
  3.1 材料与方法  26-28
    3.1.1 质粒、菌株和细胞及毒种  26
    3.1.2 主要仪器及试剂  26
    3.1.3 PCR 扩增、克隆及序列分析  26-28
  3.2 结果  28-35
    3.2.1 PCR 扩增、产物克隆、测序及 ORF 定位  28-29
    3.2.2 鸭瘟病毒 UL41、UL42 基因的分子特征  29-32
    3.2.3 鸭瘟病毒 U57、U58 基因的分子特征  32-33
    3.2.4 鸭瘟病毒 UL41、UL42 及 U57、U58 基因的进化树分析  33-35
  3.3 讨论  35-37
第四章鸭瘟病毒 TK、U545 及 U52、U510 位点重组病毒转移载体的构建  37-46
  4.1 材料与方法  37-42
    4.1.1 质粒、菌株和细胞及毒种  37
    4.1.2 主要仪器及试剂  37
    4.1.3 方法  37-42
  4.2 结果  42-44
    4.2.1 U510、TK、UL45、U52 基因转移载体的鉴定  42
    4.2.2 转移载体标记基因 EGFP 的瞬时表达检测  42-43
    4.2.3 转移载体 HA 基因的表达检测  43-44
  4.3 讨论  44-46
    4.3.1 鸭瘟病毒复制非必需区的选择  44
    4.3.2 转移载体构建策略的优化  44-45
    4.3.3 重组鸭瘟病毒的构建  45-46
第五章全文结论  46-47
参考文献  47-56
致谢  56-57
作者简历  57

鸭瘟病毒部分基因组序列的克隆及重组病毒转移载体的构建

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