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提高重组E.coli产胆固醇氧化酶水平的研究

作　者: 王长城
导　师: 杨海麟
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 胆固醇氧化酶重组E.coli JM109 高密度培养乳糖诱导
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 55次
引　用: 2次
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内容摘要

胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6 COD)在食品加工、医疗检测、生物抗虫等方面的作用日益受到人们的重视,并且显示出巨大的应用潜力。本文主要研究产COD重组E.coli的发酵优化,目的提高产酶水平。在摇瓶中优化了重组E.coli JM109的发酵培养基、诱导条件以及环境条件。结果表明,起始甘油浓度10mL/L;起始胰蛋白胨和酵母粉浓度分别为10g/L和5g/L;并在早期添加0.3mmol/L的IPTG诱导6h;以摇床转速180r/min、装液量15%、起始pH7.5、培养温度37℃以及5%的接种量为培养条件;使得摇瓶中产酶水平达到1686.57U/L。为优化前700U/L的2.4倍。研究不同的底物流加方式,实现重组E.coli的高密度培养。研究发现恒pH-stat法虽然可以获得较高的菌体干重42.68g/L(DCW),但是其发酵周期长(36h),不利于生产强度的提高;分段指数流加策略,实现了短时间内菌体的高密度培养,DCW在第14h达到40.13g/L。对高密度培养中诱导时机的优化中发现,均在发酵中期诱导效果佳,使得菌体产酶水平达到6436.56U/L,生产强度达到459.75U/(L?h),实现了重组E.coli产COD的高效表达和高效生产的统一。为优化前700U/L的9.2倍。研究以廉价无毒的乳糖代替昂贵有毒的IPTG,诱导重组E.coli表达COD的实验中发现,乳糖一方面可以作为碳源供菌体生长,另一方面又可以诱导外源基因的表达。研究中还发现在添加乳糖诱导时,菌体对乳糖有个大约10h适应期。以复合流加碳源基质(甘油和乳糖),诱导重组E.coli表达COD的研究中发现该方法并没有消除菌体对乳糖的适应期,但是采用恒pH-stat法的流加策略,克服了因适应期的长期饥饿而产生的负面影响,使得产酶水平达到6005.66U/L,为IPTG诱导的93.3%,生产强度为200.19U(L·h),为IPTG诱导的47.4%。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章绪论  7-15
  1.1 胆固醇氧化酶的研究背景  7-10
    1.1.1 COD 的来源和分布  7-8
    1.1.2 COD 酶活力的测定  8
    1.1.3 COD 的基因克隆和表达研究  8-9
    1.1.4 COD 的应用研究  9-10
  1.2 重组大肠杆菌的高密度发酵  10-14
    1.2.1 限制高密度发酵的主要因素  11-12
    1.2.2 高密度发酵的方法  12-14
  1.3 课题的研究意义及内容  14-15
第二章材料与方法  15-17
  2.1 菌种  15
  2.2 主要设备  15
  2.3 主要试剂  15
  2.4 培养基  15
  2.5 培养方法  15-16
  2.6 分析方法  16-17
    2.6.1 菌体破碎  16
    2.6.2 酶活力测定  16
    2.6.3 细胞光密度分析与菌体生物量的测定  16
    2.6.4 甘油质量浓度的测定  16
    2.6.5 乙酸质量浓度的测定  16-17
第三章结果与讨论  17-40
  3.1 产COD 重组E.coli 的摇瓶发酵条件优化  17-24
    3.1.1 发酵培养基的优化  17-19
    3.1.2 培养基优化后的生长曲线  19-20
    3.1.3 诱导条件的优化  20-21
    3.1.4 培养条件对COD 发酵生产的影响  21-23
    3.1.5 发酵培养基中乙酸浓度对COD 发酵生产的影响  23-24
  3.2 产COD 重组E.coli 的高密度发酵  24-33
    3.2.1 分批发酵  24-26
    3.2.2 补料分批发酵  26-33
  3.3 重组E.coli 产COD 的乳糖诱导策略  33-40
    3.3.1 乳糖诱导外源基因表达的摇瓶研究  34-35
    3.3.2 分批发酵中一次补加乳糖诱导的研究  35-36
    3.3.3 分批发酵中流加乳糖诱导的策略  36
    3.3.4 高密度发酵中乳糖的诱导策略  36-37
    3.3.5 高密度发酵中提高生产强度的研究  37-40
论文结论  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-48
附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  48-49
附录2：相关标准曲线  49-51

提高重组E.coli产胆固醇氧化酶水平的研究

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