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酵母甘油合成关键酶基因在大肠杆菌中的表达研究

作　者: 刘艳青
导　师: 饶志明
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 胞浆3-磷酸甘油脱氢酶 3-磷酸甘油酯酶 酶学性质 共转化 甘油产量
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 71次
引　用: 4次
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内容摘要


酵母中普遍存在葡萄糖到甘油代谢途径,对酿酒酵母的研究表明,葡萄糖分解生成磷酸二羟丙酮(DHAP),DHAP在关键酶NAD+依赖性3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)催化下还原为3-磷酸甘油。3-磷酸甘油在3-磷酸甘油酯酶(GPP)的作用下脱磷酸根而形成甘油。这两个酶分别有两个同工酶,其中GPD1和GPP2受渗透压诱导高表达。产甘油假丝酵母WL2002-5具有耐高渗且高产甘油的特性,本课题组已通过染色体步移法首次成功克隆了来源于产甘油假丝酵母的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因CgGPD1,通过基因序列比对,发现该基因是全新的基因,有关该酶的酶学性质的研究未见报道,为了能更好的解释该酶在高渗条件下保持高酶活和产甘油假丝酵母的耐高渗甘油合成的代谢机理,因此对该酶的酶学性质的研究显得十分迫切。在前期研究的基础上,首先,本课题以产甘油假丝酵母基因组DNA为模板,扩增得到3-磷酸甘油脱氢酶编码基因CgGPD1,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6His·Tag标记选用Ni2+柱纯化具有表达活性的3-磷酸甘油脱氢酶(CgGPD1),纯化后比酶活达到152.6mU/mg,并初步研究了该酶的酶学性质并与酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶ScGPD1的酶学性质进行了比较。研究发现:两种蛋白分子量大小基本相同,CgGPD1的最适pH为6.2,而ScGPD1为6.8;CgGPD1在pH3.5-7.5范围内稳定性良好,ScGPD1在pH4.5-6.2范围内稳定;CgGPD1最适温度为25℃,ScGPD1为37℃;二者均在-20℃表现出很好的稳定性;CgGPD1受Mg2+激活明显,受Zn2+完全抑制,进一步通过在产甘油假丝酵母发酵培养基中单独添加这两种离子来指导甘油发酵,ScGPD1同样受Mg2+激活,受Zn2+完全抑制;以DHAP为底物CgGPD1的Km值为0.55mmol/L,Vmax为1.06umol/(mg/min),ScGPD1的Km值为0.75mmol/L,Vmax为0.51umol/(mg/min)。其次,本研究从酿酒酵母中扩增了3-磷酸甘油酯酶编码基因GPP2(ScGPP2),构建重组菌株pET28a-ScGPP2/BL21,在大肠杆菌中对ScGPP2进行诱导表达、纯化和酶学性质的初步研究。研究发现,ScGPP2大小约为31KDa,最适pH为4.5,在pH5.5-7.5范围内具有较好的稳定性;最适温度为55℃,在4℃和-20℃均有较好的稳定性,受到Mg2+和Fe3+的激活,而Zn2+、Sn2+、Mn2+离子对该酶呈完全抑制状态;以不同浓度的3-磷酸甘油为底物,测得该酶的Km值为0.55mmol/L,Vmax为0.30umol/(mg/min)。以3-磷酸甘油为底物,进行菌株pET28a-ScGPP2/BL21的全细胞转化,证明了该酶良好的转化性能,该酶能有效的将底物3-磷酸甘油转化为甘油。最后,我们在大肠杆菌中尝试了葡萄糖到甘油代谢途径的重构。即将基因CgGPD1和ScGPP2串联表达,构建了pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21重组菌株。在1%的葡萄糖的条件下,甘油最高产量可达到1.56g/L。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章 绪论  9-17
  1.1 甘油的现状及发展  9-11
    1.1.1 甘油的理化性质及用途  9
    1.1.2 甘油的生产方法  9-10
    1.1.3 发酵法生产甘油  10
    1.1.4 甘油的合成机理  10-11
  1.2 产甘油假丝酵母  11
  1.3 3-磷酸甘油脱氢酶  11-12
  1.4 3-磷酸甘油酯酶  12-13
  1.5 融合蛋白  13-14
  1.6 酶活力测定以及影响因素  14-15
    1.6.1 酶的活力  14
    1.6.2 影响酶活力的因素  14-15
  1.7 本课题的立题意义以及内容  15-17
第二章 实验材料与方法  17-27
  2.1 实验材料  17-18
    2.1.1 实验仪器  17
    2.1.2 实验材料  17-18
      2.1.2.1 实验所用菌株和质粒  17
      2.1.2.2 化学材料  17
      2.1.2.3 培养基  17-18
  2.2 实验方法  18-27
    2.2.1 产甘油假丝酵母染色体DNA 的制备  18-19
    2.2.2 酿酒酵母染色体DNA 的制备  19
    2.2.3 PCR 引物设计  19-20
    2.2.4 PCR 扩增体系及反应条件  20
    2.2.5 PCR 产物回收  20
    2.2.6 质粒DNA 的提取  20
    2.2.7 质粒pMD18-T 与PCR 产物的连接  20
    2.2.8 重组质粒pET-28a-CgGPD1 的构建  20-21
    2.2.9 重组质粒pET-28a-ScGPD1 的构建  21
    2.2.10 重组质粒pET-28a-ScGPP2 的构建  21
    2.2.11 重组质粒pEtac-CgGPD1- ScGPP2 的构建  21-22
    2.2.12 大肠杆菌感受态的制备  22
    2.2.13 转化大肠杆菌  22
    2.2.14 重组酶在大肠杆菌中的诱导表达  22
    2.2.15 粗酶液的制备  22-23
    2.2.16 酶的Ni-NTA 纯化  23
    2.2.17 胞浆3-磷酸甘油脱氢酶酶活力测定  23
    2.2.18 3-磷酸甘油酯酶酶活力测定  23
    2.2.19 蛋白含量的测定  23-24
    2.2.20 SDS-PAGE  24
    2.2.21 酶学性质的研究方法  24
    2.2.22 3-磷酸甘油酯酶的酶学性质研究  24-25
    2.2.23 pET-28a-ScGPP2/BL21 的全细胞转化  25
    2.2.24 3-磷酸甘油的检测  25-26
    2.2.25 重组菌株pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21 的发酵过程  26
    2.2.26 重组菌株pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21 的发酵样品的分析  26-27
第三章 结果与讨论  27-47
  3.1 产甘油假丝酵母和酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及其酶学性质的研究与对比  27-35
    3.1.1 pET28a-CgGPD1 重组质粒构建及分析  27
    3.1.2 产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶（CgGPD1）的诱导表达与纯化  27-28
    3.1.3 pET28a-ScGPD1 重组质粒构建及分析  28-29
    3.1.4 酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的诱导表达以及该酶的纯化  29-30
    3.1.5 产甘油假丝酵母和酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶酶学性质的研究与对比  30-34
      3.1.5.1 酶的最适pH 值研究与对比  30-31
      3.1.5.2 酶的pH 稳定性研究与对比  31-32
      3.1.5.3 酶的最适温度研究与对比  32
      3.1.5.4 酶的热稳定性研究与对比  32-33
      3.1.5.5 金属离子以及EDTA 对两种酶的不同影响  33-34
      3.1.5.6 Km 值及Vmax 的测定与对比  34
    3.1.6 金属离子对产甘油假丝酵母发酵的影响  34-35
  3.2 酿酒酵母3-磷酸甘油酯酶在大肠杆菌中的表达纯化、酶学性质的研究以及以3-磷酸甘油为底物的全细胞转化  35-41
    3.2.1 pET28a-ScGPP2 重组质粒构建及分析  35-36
    3.2.2 3-磷酸甘油酯酶SDS-PAGE 验证图  36-37
    3.2.3 酶的最适反应pH 值和pH 稳定性研究  37-38
    3.2.4 酶的最适反应温度研究  38
    3.2.6 酶的热稳定性研究  38-39
    3.2.7 不同金属离子以及EDTA 对酶活的影响  39
    3.2.8 Km 值及Vmax 的测定  39-40
    3.2.9 以3-磷酸甘油为底物全细胞转化合成甘油  40-41
  3.3 酵母甘油合成关键酶基因CGGPD1 和SCGPP2 在大肠杆菌中的共表达  41-45
    3.3.1 重组质粒pEtac-CgGPD1-ScGPP2 的构建及酶切验证  41-42
    3.3.2 重组质粒pEtac-CgGPD1-ScGPP2 的SDS-PAGE 分析  42
    3.3.3 重组菌株pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21 发酵结果  42-45
      3.3.3.1 重组菌株pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21 发酵过程中CgGPD1 酶活变化情况  42-43
      3.3.3.2 重组菌株pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21 发酵过程中ScGPP2 酶活变化情况  43-44
      3.3.3.3 重组菌株pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21 甘油发酵情况  44-45
  3.4 小结  45-47
第四章 结论与展望  47-48
  4.1 结论  47
  4.2 展望  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-53
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的文章  53

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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