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冬凌草甲素通过激活Nrf2通路保护肝细胞的研究

作　者: 秦方园
导　师: 李燕杰；马远方
学　校: 河南大学
专　业: 免疫学
关键词: Nrf2 活性氧 冬凌草甲素
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


背景冬凌草甲素属于四环二萜类化合物,来自唇形科香茶菜属植物,我国是该属植物资源最丰富国家。冬凌草甲素具有清热解毒、消炎止痛及抗肿瘤等作用,市场上又有各种各样的冬凌草茶用于保健,其作用机理尚待研究证实。深入研究其在细胞内促凋亡、抗炎、抗氧化信号通路作用机制十分必要。我们选择了同时与抗氧化、炎症和肿瘤密切相关的Nrf2-Keap1信号通路,检测冬凌草甲素对此信号通路的作用。肝脏是人体的解毒器官,各种有害物质如酒精都是通过肝脏代谢,会对肝细胞造成一定程度的损伤,目前认为氧化损伤是其中重要的机制。而Nrf2是细胞降低活性氧,抵御外来有害刺激的重要转录因子。正常状态下Nrf2与其分子伴侣Keap1结合于胞浆中,处于功能抑制状态,并由Keap1将其带入泛素化途径进行降解,因此在细胞中的半衰期很短。在细胞受到刺激时,Nrf2从Keap1中解离以稳定状态进入细胞核内,Nrf2上具有高度保守的碱性亮氨酸链功能域,其碱性区域能够与DNA上一段特异序列ARE即抗氧化反应元件相结合促进其下游基因的转录和表达。ARE是抗氧化蛋白和一些二相解毒酶基因上游的一段转录调控因子。因此Nrf2激活后会产生抗氧化应激、降低肿瘤的易感性、神经保护、抗动脉粥样硬化、延长寿命等作用。我们经研究发现冬凌草甲素能够启动Nrf2下游基因的转录。冬凌草甲素是从冬凌草中提取出的有效成分,目前有许多有关其抗肿瘤、炎症作用的研究,但其是否能够抗氧化损伤尚不清楚。目的验证冬凌草甲素能够保护肝细胞免于氧化损伤,呈现冬凌草甲素的剂量依赖性。并且证明其抗氧化作用是通过Nrf2通路来实现的,依赖于Nrf2,从而起到保护肝脏的作用。方法构建载体pGL4.22-ARE-TATA-luciferase转染Chang’s Liver细胞,加入冬凌草甲素经荧光检测证实其的确能促进ARE荧光素酶报告基因的转录。然后通过免疫印迹及Real Time PCR法共同证明其上调了Nrf2和Nrf2下游的基因表达,再用流式细胞仪检测细胞内氧自由基水平。在以上结果都成立的基础上进行反证,即沉默细胞内Nrf2基因,再检测其对细胞的保护作用是否仍然存在。首先构建Nrf2-Knock-down载体,通过逆转录病毒感染正常肝细胞Chang’s Liver,筛选出Nrf2-Knock-down Chang’s Liver细胞系。通过免疫印迹证实此细胞系的Nrf2被沉默掉。用冬凌草甲素和酒精作用于构建成功Chang’s Liver细胞株,检测细胞内活性氧水平和培养上清中的AST水平以确定冬凌草甲素是否通过Nrf2通路保护肝脏细胞。结果冬凌草甲素能增强肝细胞内Nrf2的表达,促进其下游基因的转录,降低细胞内活性氧,减轻酒精对肝细胞的损伤。并且将Nrf2沉默后,冬凌草甲素的抗氧化损伤作用消失。说明冬凌草甲素对肝脏细胞有抗氧化损伤的保护作用,并且此作用是通过Nrf2信号通路的激活来实现的。结论冬凌草甲素是细胞内重要转录因子Nrf2的激活剂,通过激活Nrf2及其下游基因降低细胞内活性氧,减轻有害物质对肝细胞造成的氧化损伤。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-11
引言  11-14
第一部分 冬凌草甲素激活细胞内Nrf2通路的研究  14-40
  1.1 前言  14-15
  1.2 材料  15-22
    1.2.1 菌株和表达载体  15-16
    1.2.2 质粒提取扩增主要试剂  16-17
    1.2.3 细胞系及细胞培养的试剂  17-18
    1.2.4 转染真核细胞所需试剂  18-19
    1.2.5 荧光素酶报告基因检测试剂盒  19
    1.2.6 SDS-PAGE  19-20
    1.2.7 蛋白质免疫印迹  20-21
    1.2.8 活性氧检测试剂盒  21
    1.2.9 主要仪器  21-22
  1.3 方法  22-31
    1.3.1 pGL4.22-ARE-TATA-luciferrase的扩增  22
    1.3.2 制备DH5a宿主菌感受态细胞  22
    1.3.3 细胞的转化  22-23
    1.3.4 质粒扩增和提取  23-24
    1.3.5 细胞培养  24
    1.3.6 真核细胞转染  24-25
    1.3.7 荧光素酶报告基因检测  25
    1.3.8 免疫印迹  25-28
    1.3.9 细胞总RNA的提取  28-29
    1.3.10 逆转录cDNA  29-30
    1.3.11 Real Time PCR  30
    1.3.12 流式细胞仪检测细胞内活性氧  30-31
    1.3.13 荧光显微镜检测  31
  1.4 结果  31-35
    1.4.1 ARE荧光素酶报告基因检测结果  31-32
    1.4.2 免疫印迹检测Nrf2表达结果  32-33
    1.4.3 Real Time PCR检测Nrf2下游基因转录水平结果  33-34
    1.4.4 流式检测细胞内活性氧水平结果  34
    1.4.5 荧光显微镜检测细胞内活性氧结果  34-35
  1.5 讨论  35-38
  参考文献  38-40
第二部分 冬凌草甲素抗氧化损伤的Nrf2的依赖性研究  40-55
  2.1 前言  40-41
  2.2 材料  41-44
    2.2.1 菌株和表达载体  41
    2.2.2 质粒提取扩增增主要试剂  41-42
    2.2.3 细胞系及细胞培养的试剂  42-43
    2.2.4 稳定细胞系建立所需试剂  43
    2.2.5 SDS-PAGE  43
    2.2.6 蛋白质免疫印迹  43
    2.2.7 活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)  43
    2.2.8 主要仪器  43-44
  2.3 方法  44-46
    2.3.1 pRS-shRNA-Nrf2(725、726、727)与pRS-origene(724)的扩增  44
    2.3.2 制备DH5a宿主菌感受态细胞  44
    2.3.3 细胞的转化  44
    2.3.4 质粒扩增和提取  44
    2.3.5 细胞培养  44
    2.3.6 稳定细胞系的建立  44-45
    2.3.7 免疫印迹检测(Immunoblotting)  45-46
    2.3.8 流式细胞仪检测细胞内活性氧  46
    2.3.9 细胞上清AST水平的检测  46
  2.4 结果  46-51
    2.4.1 沉默细胞株鉴定结果  46-48
    2.4.2 流式细胞仪检测Nrf2沉默及表正常细胞株氧自由基水平结果  48-49
    2.4.3 细胞培养上清中AST水平检测结果  49-51
  2.5 讨论  51-53
  参考文献  53-55
结论  55-56
综述  56-66
  参考文献  62-66
附录  66-67
致谢  67-68
在读期间发表的学术论文与研究成果  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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