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建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测苏丹红Ⅰ

作 者: 朱立鑫
导 师: 刘仁荣
学 校: 南昌大学
专 业: 食品生物技术
关键词: 苏丹红Ⅰ 环氧氯丙烷 免疫亲和色谱 高效液相色谱
分类号: O657.72
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


本研究采用环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶4FF (Sepharose 4FF),通过ε-氨基己酸(AHA)修饰,获得免疫亲和基质,并与抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体偶联,制备苏丹红Ⅰ免疫亲和柱,同时建立了免疫亲和柱联高效液相色谱法(Immunoaffinity column-High Performance Liquid Chromatography, IAC-HPLC)检测辣椒粉加标样品中的苏丹红Ⅰ。研究结果如下:1琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的活化与修饰采用环氧氯丙烷法活化Sepharose 4FF,对Sepharose 4FF预处理、反应温度、反应时间、DMSO百分比、NaOH浓度和环氧氯丙烷百分比分别进行优化,确定了40℃反应2 h 20 min、46.8% DMSO、30% ECH和NaOH初始浓度为8 mol/L、终浓度为0.8 mol/L为最佳反应条件,在此条件下,环氧基活化率能到达80μmol/g。采用ε-氨基己酸为间隔臂修饰环氧氯丙烷法活化的Sepharose 4FF (Sepharose 4FF-epoxy),确定了以pH 8.30.1 mol/L NaHCO3含0.5 mol/L NaCl、25℃偶联8.5 h为最佳反应条件。2 Sepharose 4FF-epoxy-s-氨基己酸与配体的偶联反应将Sepharose 4FF-epoxy-s-氨基己酸与氨基化苏丹红反应,对反应条件EDAC浓度、反应温度和时间进行优化,确定了以EDAC浓度为19mg/mL、27℃、16h为最佳反应条件。氨基与羧基偶联过程中,考虑到温度过高会造成抗体活性的破坏,在4℃条件下,进一步优化,确定了以EDAC浓度为19mg/mL、反应72h为最佳反应条件。3抗SudanⅠ单克隆抗体免疫亲和柱的制备将辛酸-硫酸铵法纯化的抗SudanⅠ单克隆抗体与ε-氨基己酸修饰的琼脂糖凝胶Sepharose 4FF偶联。采用HPLC方法检测免疫亲和柱的柱容量。抗Sudan I单克隆抗体免疫亲和柱以0.3 g带羧基的琼脂糖凝胶4FF与1 mg苏丹红Ⅰ单抗偶联,柱容量为1.6μg。4建立IAC-HPLC检测苏丹红Ⅰ将苏丹红Ⅰ样品过免疫亲和柱,乙腈洗脱后以高效液相色谱法(HPLC)检测,紫外检测波长为478 nm,流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈-0.1%甲酸乙腈溶液-丙酮(体积比为21.25:3.75:60:15)。对免疫亲和柱的操作条件即上样缓冲液、上样方式、洗脱液体积进行优化,并对免疫亲和柱的稳定性进行了测定。结果显示以20%乙腈-PBS、上样一次、3 mL乙腈洗脱液为最佳条件。在加标实验中,辣椒粉以0.25~3mg/kg水平添加SudanⅠ标准品,平均回收率为44.52%-77.40%,相对标准偏差为4.6%-8.3%,最低检出限为125ng/mL。

全文目录


缩略语  3-4
摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章 综述  10-22
  1.1 苏丹红的性质与危害  10-11
  1.2 苏丹红检测方法的研究进展  11-13
    1.2.1 薄层色谱法(TLC)  11
    1.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)  11-12
    1.2.3 高效液相色谱法(HPLC)  12
    1.2.4 其他方法  12-13
  1.3 苏丹红纯化方法的研究进展  13-14
    1.3.1 样品中苏丹红的提取  13
    1.3.2 苏丹红提取液的净化  13-14
  1.4 免疫亲和柱制备的研究  14-17
    1.4.1 抗体的获得  14-15
    1.4.2 载体的选择和活化  15
    1.4.3 抗体或抗原与载体偶联  15-16
    1.4.4 免疫亲和介质的装柱和样品的净化  16-17
  1.5 免疫亲和柱的应用  17-20
    1.5.1 免疫亲和柱与其他分析技术联用  17
    1.5.2 IAC在真菌毒素检测中的应用  17-18
    1.5.3 IAC在农药残留检测中的应用  18-19
    1.5.4 IAC在兽药残留检测中的应用  19
    1.5.5 IAC在筛选药物有效成分研究中的应用  19-20
    1.5.6 IAC在特异性去除高丰度蛋白中的应用  20
  1.6 主要研究内容、目的和意义  20-22
    1.6.1 本研究的目的和主要研究内容  20-21
    1.6.2 本研究的意义  21-22
第二章 苏丹红免疫亲和柱的制备  22-61
  2.1 仪器与试剂  22-26
    2.1.1 实验材料  22
    2.1.2 仪器与设备  22-23
    2.1.3 试剂与溶液的配制  23-26
  2.2 实验方法与步骤  26-41
    2.2.1 Sepharose 4FF的活化  26-30
    2.2.2 氨基化苏丹红的制备  30-32
    2.2.3 建立酶联免疫吸附试验检测苏丹红  32-35
    2.2.4 抗苏丹红免疫亲和柱的制备  35-40
    2.2.5 建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测样品中的苏丹红  40-41
  2.3 实验结果  41-61
    2.3.1 Sepharose 4FF的活化  41-44
    2.3.2 氨基化苏丹红的制备  44-47
    2.3.3 建立酶联免疫吸附试验检测苏丹红  47-49
    2.3.4 抗苏丹红免疫亲和柱的制备  49-58
    2.3.5 建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测样品中的苏丹红  58-61
第三章 小结  61-63
  3.1 琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的活化  61
  3.2 制备了氨基化苏丹红  61
  3.3 活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的修饰  61
  3.4 研制了抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体免疫亲和柱  61-62
  3.5 建立了IAC-HPLC检测苏丹红Ⅰ  62-63
第四章 讨论  63-67
  4.1 载体的活化和修饰  63-64
    4.1.1 载体活化方法  63-64
    4.1.2 载体的修饰  64
  4.2 免疫亲和柱的研制  64-65
    4.2.1 抗体的纯化  64-65
    4.2.2 偶联  65
    4.2.3 保存  65
  4.3 高效液相色谱法检测  65-67
    4.3.1 色谱条件  65-66
    4.3.2 加标实验方法  66-67
本研究的创新之处  67-68
致谢  68-69
参考文献  69-73

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法(物理及物理化学分析法) > 色谱分析 > 液相色谱分析法
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