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建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测苏丹红Ⅰ
作 者: 朱立鑫
导 师: 刘仁荣
学 校: 南昌大学
专 业: 食品生物技术
关键词: 苏丹红Ⅰ 环氧氯丙烷 免疫亲和色谱 高效液相色谱
分类号: O657.72
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
本研究采用环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶4FF (Sepharose 4FF),通过ε-氨基己酸(AHA)修饰,获得免疫亲和基质,并与抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体偶联,制备苏丹红Ⅰ免疫亲和柱,同时建立了免疫亲和柱联高效液相色谱法(Immunoaffinity column-High Performance Liquid Chromatography, IAC-HPLC)检测辣椒粉加标样品中的苏丹红Ⅰ。研究结果如下:1琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的活化与修饰采用环氧氯丙烷法活化Sepharose 4FF,对Sepharose 4FF预处理、反应温度、反应时间、DMSO百分比、NaOH浓度和环氧氯丙烷百分比分别进行优化,确定了40℃反应2 h 20 min、46.8% DMSO、30% ECH和NaOH初始浓度为8 mol/L、终浓度为0.8 mol/L为最佳反应条件,在此条件下,环氧基活化率能到达80μmol/g。采用ε-氨基己酸为间隔臂修饰环氧氯丙烷法活化的Sepharose 4FF (Sepharose 4FF-epoxy),确定了以pH 8.30.1 mol/L NaHCO3含0.5 mol/L NaCl、25℃偶联8.5 h为最佳反应条件。2 Sepharose 4FF-epoxy-s-氨基己酸与配体的偶联反应将Sepharose 4FF-epoxy-s-氨基己酸与氨基化苏丹红反应,对反应条件EDAC浓度、反应温度和时间进行优化,确定了以EDAC浓度为19mg/mL、27℃、16h为最佳反应条件。氨基与羧基偶联过程中,考虑到温度过高会造成抗体活性的破坏,在4℃条件下,进一步优化,确定了以EDAC浓度为19mg/mL、反应72h为最佳反应条件。3抗SudanⅠ单克隆抗体免疫亲和柱的制备将辛酸-硫酸铵法纯化的抗SudanⅠ单克隆抗体与ε-氨基己酸修饰的琼脂糖凝胶Sepharose 4FF偶联。采用HPLC方法检测免疫亲和柱的柱容量。抗Sudan I单克隆抗体免疫亲和柱以0.3 g带羧基的琼脂糖凝胶4FF与1 mg苏丹红Ⅰ单抗偶联,柱容量为1.6μg。4建立IAC-HPLC检测苏丹红Ⅰ将苏丹红Ⅰ样品过免疫亲和柱,乙腈洗脱后以高效液相色谱法(HPLC)检测,紫外检测波长为478 nm,流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈-0.1%甲酸乙腈溶液-丙酮(体积比为21.25:3.75:60:15)。对免疫亲和柱的操作条件即上样缓冲液、上样方式、洗脱液体积进行优化,并对免疫亲和柱的稳定性进行了测定。结果显示以20%乙腈-PBS、上样一次、3 mL乙腈洗脱液为最佳条件。在加标实验中,辣椒粉以0.25~3mg/kg水平添加SudanⅠ标准品,平均回收率为44.52%-77.40%,相对标准偏差为4.6%-8.3%,最低检出限为125ng/mL。
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全文目录
缩略语 3-4 摘要 4-6 ABSTRACT 6-10 第一章 综述 10-22 1.1 苏丹红的性质与危害 10-11 1.2 苏丹红检测方法的研究进展 11-13 1.2.1 薄层色谱法(TLC) 11 1.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) 11-12 1.2.3 高效液相色谱法(HPLC) 12 1.2.4 其他方法 12-13 1.3 苏丹红纯化方法的研究进展 13-14 1.3.1 样品中苏丹红的提取 13 1.3.2 苏丹红提取液的净化 13-14 1.4 免疫亲和柱制备的研究 14-17 1.4.1 抗体的获得 14-15 1.4.2 载体的选择和活化 15 1.4.3 抗体或抗原与载体偶联 15-16 1.4.4 免疫亲和介质的装柱和样品的净化 16-17 1.5 免疫亲和柱的应用 17-20 1.5.1 免疫亲和柱与其他分析技术联用 17 1.5.2 IAC在真菌毒素检测中的应用 17-18 1.5.3 IAC在农药残留检测中的应用 18-19 1.5.4 IAC在兽药残留检测中的应用 19 1.5.5 IAC在筛选药物有效成分研究中的应用 19-20 1.5.6 IAC在特异性去除高丰度蛋白中的应用 20 1.6 主要研究内容、目的和意义 20-22 1.6.1 本研究的目的和主要研究内容 20-21 1.6.2 本研究的意义 21-22 第二章 苏丹红免疫亲和柱的制备 22-61 2.1 仪器与试剂 22-26 2.1.1 实验材料 22 2.1.2 仪器与设备 22-23 2.1.3 试剂与溶液的配制 23-26 2.2 实验方法与步骤 26-41 2.2.1 Sepharose 4FF的活化 26-30 2.2.2 氨基化苏丹红的制备 30-32 2.2.3 建立酶联免疫吸附试验检测苏丹红 32-35 2.2.4 抗苏丹红免疫亲和柱的制备 35-40 2.2.5 建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测样品中的苏丹红 40-41 2.3 实验结果 41-61 2.3.1 Sepharose 4FF的活化 41-44 2.3.2 氨基化苏丹红的制备 44-47 2.3.3 建立酶联免疫吸附试验检测苏丹红 47-49 2.3.4 抗苏丹红免疫亲和柱的制备 49-58 2.3.5 建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测样品中的苏丹红 58-61 第三章 小结 61-63 3.1 琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的活化 61 3.2 制备了氨基化苏丹红 61 3.3 活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的修饰 61 3.4 研制了抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体免疫亲和柱 61-62 3.5 建立了IAC-HPLC检测苏丹红Ⅰ 62-63 第四章 讨论 63-67 4.1 载体的活化和修饰 63-64 4.1.1 载体活化方法 63-64 4.1.2 载体的修饰 64 4.2 免疫亲和柱的研制 64-65 4.2.1 抗体的纯化 64-65 4.2.2 偶联 65 4.2.3 保存 65 4.3 高效液相色谱法检测 65-67 4.3.1 色谱条件 65-66 4.3.2 加标实验方法 66-67 本研究的创新之处 67-68 致谢 68-69 参考文献 69-73
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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法(物理及物理化学分析法) > 色谱分析 > 液相色谱分析法
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