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一组氯离子转运体KCC2和NKCC1在黑质网状部的表达及其参与肝性脑病的GAD67-GFP转基因小鼠的研究

作　者: 李俊杰
导　师: 窦科峰；王亚云；杨雁灵
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 肝性脑病黑质网状部 GABA能神经元 KCC2 NKCC1 GAD67-GFP基因敲入小鼠
分类号: R747.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 85次
引　用: 1次
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内容摘要

肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)是肝病患者最常见的并发症和死亡原因之一,尽管关于其发病机制的学说众多,但是至今尚未予以完全阐明,临床上也无特效疗法,使得肝性脑病的实验研究具有十分重要的必要性和紧迫性。近年来发现,中枢神经系统内重要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸(Gamma-amino butyric acid,GABA)与肝性脑病的脑细胞功能紊乱有着明显关系,而KCC2和NKCC1是调控GABA状态的一组氯离子转运体。因此,可以此为契入点,研究HE状态下GABA的可塑性变化,从新的角度来阐明HE的中枢机制。目的:1、观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠黑质网状部(SNr)内,表达GFP的GABA能神经元与一对功能相反的Cl-共转运体(K+-Cl- cotransporter 2,KCC2;Na+-K+-Cl- cotransporter 1,NKCC1)的共存情况。2、建立检测正常小鼠及肝性脑病小鼠不同阶段黑质网状部KCC2和NKCC1表达的SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR的方法,并探讨其在肝性脑病发病机制中的作用。方法:1、分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合以及GFP与KCC2或NKCC1免疫荧光染色相结合的双重标记方法,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下同时进行观察。2、采用国际上广泛采用的硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射致肝性脑病动物模型,SYBR荧光实时定量PCR检测正常小鼠及不同阶段肝性脑病小鼠黑质网状部KCC2和NKCC1的表达。结果:1、SNr内95%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2 mRNA,而50%表达KCC2 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性。2、SNr内80%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1 mRNA,约35%表达NKCC1 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性。3、SNr内90%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2,双标神经元约占KCC2阳性神经元的50.5%。4、SNr内80.5%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1,双标神经元约占NKCC1阳性神经元的42.5%。5、与正常小鼠相比,肝性脑病小鼠建模成功后第1天黑质网状部KCC2表达降低(P<0.05),NKCC1升高(P<0.05),此后KCC2逐渐升高,NKCC1逐渐回落,至第4周时与正常小鼠相比,KCC2仍降低(P<0.05),NKCC1仍升高(P<0.05),至第8周时两者表达与正常表达无明显差异。结论:1、以上结果表明,SNr内表达GFP的GABA能神经元大部分与KCC2和NKCC1共存,提示氯离子共转运体可能对SNr内GABA能神经元起重要的调控作用。2、KCC2和NKCC1的表达与肝性脑病急性发病有关,随着病程的进展,机体作出代偿性调整,导致KCC2和NKCC1的表达逐渐恢复到正常水平。KCC2和NKCC1的表达变化,以及其所引起的GABA状态的改变,可能是肝性脑病的中枢发病机制之一。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-15
文献回顾  15-28
正文  28-51
  实验一 GAD67-GFP基因敲入小鼠黑质网状部神经元GABA与氯离子转运体KCC2 和NKCC1 的共存  28-39
    1 前言  28-29
    2 材料和方法  29-32
    3 结果  32-33
    4 讨论  33-39
  实验二 SYBR荧光实时定量PCR检测肝性脑病小鼠黑质网状部KCC2 和NKCC1 的表达  39-51
    1 前言  39-40
    2 材料  40
    3 方法  40-44
    4 结果  44-49
    5 讨论  49-51
小结  51-53
参考文献  53-60
个人简历和研究成果  60-61
致谢  61

一组氯离子转运体KCC2和NKCC1在黑质网状部的表达及其参与肝性脑病的GAD67-GFP转基因小鼠的研究

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