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乳腺癌细胞中转录因子AP-2γ的靶基因的鉴定

作　者: 肖湘文
导　师: 张健；周畅
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学及分子生物学
关键词: 转录因子AP-2γ 乳腺癌 染色质免疫共沉淀 癌症形成
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


转录激活因子AP-2γ是转录因子激活蛋白AP-2家族中的一员,它在人类的癌症发生、发展过程中起着重要作用。AP-2γ蛋白在人的乳腺癌细胞中有高表达,并且在乳腺癌的不同形成过程中起着双重作用:抑制肿瘤的发生和促进细胞增值。为了鉴定AP-2γ转录因子所调节的下游靶基因,我们在乳腺癌细胞系MDA-MB-453中开展了染色质免疫共沉淀实验(ChIP)来鉴定AP-2γ转录因子的结合位点。通过对这些AP-2γ-ChlP来源的DNA片段的细胞克隆和测序发现了20个新的AP-2γ转录因子的潜在的靶基因,这些靶基因在调节癌症的形成,细胞新陈代谢等方面起着相应的生物学功能。通过测序分析、报告基因分析、相对定量PCR实验分析、电泳迁移率变动分析试验和免疫印记实验分析再次鉴定和证实这些AP-2γ转录因子的未知的下游靶基因。已有报道表明ErbB2基因是AP-2γ转录因子的下游靶基因,我们的实验结果与这一报道结果相一致。干扰AP-2γ在人的乳腺癌细胞系中的表达和促进AP-2γ在人的乳腺癌细胞系中的过量表达都显著的改变了与AP-2γ具有潜在结合位点的ErbB2,CDH2,IGSF11和HPSE这四个基因的表达水平,这表明AP-2γ可以直接调控这些基因的表达。这些数据表明AP-2γ可以协调一系列基因的表达,这些基因在癌症形成尤其是乳腺癌形成过程中起作用。这些AP-2γ的新的下游靶基因,可以用来作为抗癌治疗中的靶标。所有这些发现展示了AP-2γ转录因子的重要的生物学功能,以及在癌症靶标治疗方面的重要潜能作用。

全文目录


专业名词缩写中英文对照简表  3-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
前言  12-28
  1 转录激活因子AP-2基因家族  12-17
    1.1 转录激活因子AP-2基因家族的结构特点  12-14
    1.2 转录激活因子AP-2γ的生物学功能  14-15
    1.3 AP-2蛋白家族与乳腺癌的关系  15-17
  2 染色质免疫沉淀技术(ChIP)  17-20
    2.1 ChIP技术的原理  18-19
    2.2 在反式作用因子的靶序列的研究领域  19-20
  3 受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 precursor,ErbB2)的简介  20-22
    3.1 ErbB2的分布、定位与结构  20
    3.2 erbB2与乳腺癌  20-21
    3.3 erbB2信号途径与乳腺癌  21-22
  4 神经-钙粘素(N-cadherin,CDH2)的简介  22-24
    4.1 N-cadherin的分布、定位与结构  23
    4.2 N-cadherin的分子生物学性能  23-24
    4.3 N-cadherin与乳腺瘤  24
  5 乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)的简介  24-27
    5.1 HPSE基因的分布、定位与结构  24-25
    5.2 HPSE的分子生物学性能  25-26
    5.3 HPSE与肿瘤转移  26-27
  6 免疫球蛋白超家族成员11(Immunoglobulin superfamily member 11,IGSF11)的简介  27-28
第一部分 材料与方法  28-46
  1 材料  28-34
    1.1 菌种和细胞株  28
    1.2 载体和工具酶  28
    1.3 抗体  28
    1.4 试剂盒  28
    1.5 其它试剂  28-29
    1.6 所需溶液  29-32
    1.7 siRNA干扰序列  32
    1.8 主要仪器设备  32-34
  2 实验方法  34-46
    2.1 细胞培养  34-35
    2.2 免疫沉淀和Western Blot检测  35-37
    2.3 染色质免疫沉淀(ChIP)  37-38
    2.4 AP-2γ-ChIP-PCR扩增实验  38-39
    2.5 野生型和突变型pTAL-ChIP-DNA载体的构建及寡核苷酸合成  39-41
    2.6 细胞转染和萤光素酶试验(Luciferase assay)  41-42
    2.7 RNA抽提和相对定量RT-PCR  42-44
    2.8 电泳迁移率变动分析试验(EMSA)  44-45
    2.9 统计学分析  45-46
第二部分 结果分析  46-55
  1 pUC19-ChIP-DNA质粒的测序结果及分析  46-47
  2 AP-2γ-ChIP-PCR实验检验AP-2γ转录因子与R3-36,R4-28,R1-15片段结合的特异性  47-48
  3 AP-2γ转录因子影响了R3-1,R3-36,R4-28,R1-15片段的转录活性  48-51
  4 AP-2γ-ChIP-DNA片段上AP-2γ的潜在结合位点的鉴定  51-52
  5 AP-2γ转录因子影响了ErbB2,CDH2,IGS11l和HPSE基因的mRNA的转录水平  52-53
  6 AP-2γ调控ErbB2,CDH2,IGSF11和HPSE的蛋白表达  53-55
第三部分 讨论  55-60
参考文献  60-66
附录  66-68
致谢  68-70

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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