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一种光敏剂结合蛋白（PBP）的筛选，原核表达纯化及其与光敏剂的亲和功能研究

作　者: 郭艳荣
导　师: 魏勋斌；朱乃硕
学　校: 复旦大学
专　业: 微生物学
关键词: 光动力学治疗 光敏剂 光敏剂结合蛋白 人类翻译延伸因子
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 73次
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内容摘要


癌症光动力学治疗(Photodynamic therapy, PDT),尤其是ALA-PDT在各种皮肤癌以及腔镜肿瘤如食道癌,膀胱癌,肺癌,子宫颈癌等治疗中临床应用效果比较明显,且PpⅨ荧光可以作为肿瘤初期检测,其在肿瘤检测和治疗中有很广泛的应用前景。光敏剂富集于肿瘤细胞作为光动力学治疗中应用的基础,其选择性富集于肿瘤细胞的机制尚不明确。本论文拟通过筛选肿瘤细胞内是否存在光敏剂特异性的受体蛋白,来探究光敏剂选择性富集肿瘤细胞机制。以光敏剂PpⅨ为探针,通过亲和淘洗,分子印迹技术以及荧光分析技术,从人肝cDNA噬菌体表达库中筛选出一株编码光敏剂结合蛋白的cDNA克隆。经基因测序分析,该cDNA与噬菌体展示序列构成独立的开放阅读框架,编码一个由25个氨基酸残基构成的多肽,该多肽为eEF1A1 C末端LysM,暂命名为光敏剂结合多肽(photosensitizer binding peptide, PBPe),而包含PBPe序列(70%以上相似,且有同样光敏剂亲和作用)的蛋白如eEF1A1命名为光敏剂结合蛋白(photosensitizer binding protein, PBPr)。将编码eEF1A1基因的表达框克隆到原核表达载体pet22b(+)中,转化E.coli菌株BL21(DE3)感受态,获得周质空间分泌表达eEF1A1的BL21转化菌株。经IPTG诱导表达后,通过超滤和His-tag亲和层析的方法纯化获得了一定量的重组eEF1A1蛋白。人工合成了PBPe, eEF1A1 C末端LysM (25aa)多肽。并分别采用HPLC测得纯度以及进行了MS鉴定。ELISA法证实PBPr和PBPe都具有与光敏剂PpIX特异性结合的能力,并采用BIAcore分子互作仪分别测定PBP与PpⅨ之间亲和常数。为了进一步在细胞水平研究PBP与PpⅨ的亲和功能,分别将eEF1A1全长基因序列(简称A)、eEFlAl C末端LysM序列(简称C)以及缺失C末端LysM序列的eEF1A1基因序列(简称B)克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建eEF1A1三个亚单位的GFP融合表达质粒。通过细胞瞬时转染以及流式细胞术获得上述GFP标记的PBP高表达细胞株,加入5-ALA后一定时间内,在共聚焦显微镜下定性观察到PBP高表达细胞组具有富集光敏剂PpⅨ的作用,并采用多功能酶标仪定量测定PBP高表达细胞组PpⅨ富集量,从而在细胞水平上验证了PBP与光敏剂的亲和功能。eEF1A1作为重要的翻译延伸因子,在细胞内重要蛋白如酶类合成中起关键作用,参与细胞骨架活动与蛋白降解过程,同时在细胞增殖以及细胞周期起重要作用,其作为光敏剂结合蛋白的功能提示PDT在临床应用的新机制。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
第一部分 前言  7-12
  一. 癌症光动力学治疗概述  7-9
  二. 光敏剂靶向机制研究进展  9
  三. 噬菌体展示库筛选技术简介  9-10
  四. 人类翻译延伸因子eEF1A1概述  10-12
第二部分 论文正文  12-62
  第一章 从人肝cDNA噬菌体展示库中筛选PBP  12-30
  第二章 原核表达PBPr与人工合成PBPe  30-49
  第三章 PBP与卟啉类光敏剂体内外亲和功能研究  49-62
全文总结  62-64
参考文献  64-70
致谢  70-71

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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