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Ang-1、Ang-2的表达与NPC淋巴转移的关系及PDT抗淋巴转移作用的体外实验研究

作　者: 胡可锦
导　师: 唐瑶云
学　校: 中南大学
专　业: 临床医学
关键词: NPC 微淋巴管密度 Ang-1 Ang-2 光动力学治疗
分类号: R739.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 36次
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内容摘要

研究目的鼻咽癌（nasopharyngeal carcinom,NPC）的淋巴结转移高倾向性及潜在的远处转移风险严重影响病人的预后。本研究首先明确淋巴管生成因子Ang-1、Ang-2（angiopoietin,Ang）在NPC中的表达与淋巴结转移之间的关系,初步阐述其在肿瘤微淋巴管生成中的作用;然后进行体外实验,利用光动力学治疗（Photodynamic therapy,PDT）处理NPC细胞包括CNE-2（高成瘤,低转移）和5-8F（高成瘤,高转移）2个细胞亚株,以观察对上述蛋白表达的影响,同时探讨PDT除高效杀瘤作用之外的其它抑制肿瘤转移的作用机制,为下一步进行PDT抗淋巴结转移的体内实验奠定良好基础。研究方法1)利用D2-40单克隆抗体标记NPC组织的微淋巴管,观察记录微淋巴管密度（lymphatic microvessel density,LMVD）,与临床资料（性别、年龄、T分期、N分期及临床分期等）进行相关性分析。2)使用免疫组化技术检测NPC组织的Ang-1、Ang-2表达水平,分别与临床资料及LMVD进行相关性分析,说明两者在淋巴管生成中的作用。3)以空白对照组、单加光敏剂组及单用激光照射组为对照,利用荧光检测技术、CCK-8比色法摸索PDT对CNE-2和5-8F细胞亚株的半数致死剂量(LD₅₀)。4)使用平板克隆形成试验研究存活于PDT后的CNE-2和5-8F细胞亚株分别在形态学、增殖等方面的改变,并建立各自稳定传代的细胞株备用。5)研究存活于PDT后的CNE-2和5-8F细胞株在增殖、粘附（CCK-8比色法）和迁移（细胞划痕实验）等方面的改变。6)使用免疫细胞化学及IPP6.0图像分析软件进行半定量处理,分别检测存活于PDT后的CNE-2和5-8F细胞亚株中Ang-1、Ang-2的表达水平变化。研究结果1) D2-40成功地用于标记组织中的微淋巴管;各组瘤周LMVD（pLMVD）均要高于瘤内LMVD（iLMVD）,差异有显著性（所有P值均＜0.05）;pLMVD或iLMVD在N分期中均存在统计学差异,淋巴结转移组的LMVD均要高于无淋巴结转移组的LMVD（P分别＜0.005和＜0.01）。2) Ang-1、Ang-2在NPC中的阳性表达率分别为46.15%和63.5%;发生淋巴结转移的Ang-1、Ang-2表达水平均高于未发生淋巴结转移者（P＜0.05）,而与性别、年龄、T分期等因素无明显相关性;Ang-1、Ang-2均呈阳性表达时发生淋巴结转移率最高,单纯Ang-2阳性次之,Ang-1阳性或两者均为阴性时则无明显差别。3) Ang-1、Ang-2同时呈阳性表达时,pLMVD或iLMVD均明显高于其它表达状态（P＜0.05）,单独Ang-1表达、单独Ang-2表达及两者都无表达组之间无明显差异。4)成功找到CNE-2和5-8F细胞亚株的PDT半数致死剂量(LD₅₀),前者为0.25mmol/L-2h-1.44J/cm²,后者为0.50mol/L-2h-1.21 J/cm²。5)连续进行细胞形态学观察,发现存活于PDT后的CNE-2和5-8F细胞亚株大多呈多边形、细胞排列相对紧凑;进一步实验发现,在增殖能力有一定下降、粘附力改变不明显、迁移能力明显下降,上述改变以5-8F细胞亚株尤为明显。6)存活于PDT后的CNE-2和5-8F细胞亚株的Ang-1、Ang-2表达水平均明显下降,以5-8F细胞亚株尤为明显。研究结论1)肿瘤微淋巴管可能是NPC发生淋巴结转移的重要因素;2) Ang-1、Ang-2与NPC淋巴结转移密切相关,可能是通过参与肿瘤微淋巴管的形成促进其转移的,可作为预测发生淋巴结转移的风险因子及未来抗淋巴结转移的潜在治疗靶点。3)存活于PDT的NPC细胞在增殖、迁移能力及Ang-1、Ang-2表达水平均出现不同程度的减弱或下调,可能是PDT抑制肿瘤转移的其它重要机制。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
缩写词注释及中英文对照  11-12
前言  12-14
实验流程  14-15
第一章 Ang-1、Ang-2在NPC中的表达与淋巴管生成的相关性研究  15-25
  1.1 材科  15-16
    1.1.1 组织标本  15
    1.1.2 临床资料及分组  15
    1.1.3 试剂  15-16
    1.1.4 辅助试剂  16
    1.1.5 主要仪器  16
  1.2 方法  16-17
    1.2.1 切片  16
    1.2.2 苏木素-伊红染色(HE染色)  16
    1.2.3 按SABC法进行免疫组化染色  16-17
  1.3 结果判定及评价方法  17-18
    1.3.1 微淋巴管密度(LMVD)的计算方法  17
    1.3.2 Ang-1、Ang-2阳性结果判定  17-18
  1.4 数据统计  18
  1.5 结果  18-22
    1.5.1 D2-40标记的微淋巴管与临床病理参数之间的关系  18
    1.5.2 Ang-1、Ang-2阳性表达及其与临床病理参数之间的关系  18
    1.5.3 联合Ang-1、Ang-2在NPC中的表达与LMVD之间的关系  18-22
  1.6 讨论  22-23
  1.7 结论  23-25
第二章、5-ALA介导的PDT对NPC细胞的增殖、黏附及迁移能力的影响及下调Ang-1、Ang-2表达的体外实验研究  25-41
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 细胞株  25
    2.1.2 主要试剂  25
    2.1.3 主要仪器  25-26
  2.2 方法  26-30
    2.2.1 细胞复苏及培养  26
    2.2.2 光敏剂的配置  26
    2.2.3 半导体激光器能量参数设定  26
    2.2.4 制备单细胞悬液  26
    2.2.5 PDT处理CNE-2细胞及5-8F细胞的半数致死剂量摸索  26-28
    2.2.7 细胞增殖分析  28
    2.2.8 细胞在细胞外基质黏附测定  28
    2.2.9 细胞划痕实验  28-29
    2.2.10 细胞免疫化学染色  29-30
  2.3 统计学分析  30
  2.4 结果  30-38
    2.4.1 PDT处理CNE-2细胞及5-8F细胞的亚致死剂量  30-33
    2.4.2 PDT后细胞形态观察  33-34
    2.4.3 PDT对细胞增殖、粘附和迁移的影响  34-36
    2.4.4 PDT下调Ang-1、Ang2的表达  36-38
  2.5 讨论  38-40
  2.6 结论  40-41
参考文献  41-48
综述:肿瘤血管靶向性PDT在鼻咽癌治疗中的应用  48-55
  参考文献  52-55
致谢  55

Ang-1、Ang-2的表达与NPC淋巴转移的关系及PDT抗淋巴转移作用的体外实验研究

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