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OECs、SCs对NSCs、BMSCs、HSCs存活、增殖、分化及神经营养因子表达的影响

作　者: 陈珊珊
导　师: 王廷华
学　校: 昆明医学院
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 神经干细胞 骨髓基质干细胞 造血干细胞 嗅鞘细胞 雪旺细胞 共培养
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


[目的]探讨SD大鼠源性嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)、雪旺细胞(schwann cells, SCs)分别对神经干细胞(neural stem cells, NSCs)、骨髓基质干细胞(bone morrow stromal cells, BMSCs)、造血干细胞(haemopoietic stem cells, HSCs)活力、增殖、分化、营养因子表达的影响,为应用支持细胞联合于细胞移植治疗神经系统疾病提供理论和实验依据。[方法]本实验分为NSCs单独培养组、NSCs/OECs共培养组、NSCs/SCs共培养组；BMSCs单独培养组、BMSCs/OECs共培养组、BMSCs/SCs共培养组；HSCs单独培养组、HSCs/OECs共培养组及HSCs/SCs共培养组。体外分别取材、纯化、传代培养NSCs、BMSCs、HSCs、OECs、SCs至第三代并分别进行细胞特异性表面标记物nestin、CD44、CD34、P75、S100染色鉴定,再将已鉴定的第三代OECs、SCs分别与NSCs、BMSCs、HSCs在Millipore嵌入性培养板中共培养7天,以单独培养组单独组为对照观察各组干细胞形态、数量、神经球数量及大小变化；MTT检测各组干细胞活力；用免疫组织化学(IHC)染色以β-TubulinⅢ、NF、Neun、Gale、GFAP为标记了解各干细胞分化情况；用RT-PCR检测部分神经营养因子及受体的表达情况。使用Image-Pro Plus和Image J软件对实验图片进行计数及灰度测量,用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。[结果]1、体外细胞培养及鉴定：培养的NSCs、BMSCs、HSCs、OECs、SCs分别经nestin、CD44、CD34、P75、S100 IHC染色鉴定呈阳性反应。2、细胞计数结果：2.1与OECs共培养后的BMSCs(114±23.4)和与SCs共培养后的BMSCs(134.2±14.0)的细胞数量均较BMSCs单独培养组(61.4±15.0)增多；且SCs共培养后的BMSCs组亦较OECs共培养后的BMSCs组多,均有统计学意义(p<0.05)：2.2与OECs共培养后的HSCs(109.0±17.8)和与SCs共培养后的HSCs(180.5±24.5)的细胞数量均较HSCs单独培养组(95.4±18.9)明显增多；且SCs共培养后的HSCs组亦较OECs共培养后的HSCs组多,均有统计学意义(p<0.05)。3、神经球计数及直径测量：3.1 OECs共培养后的NSCs组(68.9±15.8)和SCs共培养后的NSCs组(64.7±10.7)的神经球数量均较NSCs单独培养组(50.3±9.8)明显增多,其差异有统计学意义(p<0.05)；而OECs共培养后的NSCs组与SCs共培养后的NSCs组比较无统计学差异；3.2 OECs共培养后的NSCs组(154.1±69.3Pixels)和SCs共培养后的NSCs组(188.3±73.4 Pixels)的神经球直径均较NSCs单独培养组(109.8±50.5Pixels)明显增大；且SCs共培养后的NSCs组亦较OECs共培养后的NSCs组神经球直径大,均有统计学意义(p<0.05)。4、MTT检测结果：4.1 OECs共培养后的BMSCs组(0.149±0.006)和SCs共培养后的BMSCs组(0.188±0.007)的细胞MTT检测值均较BMSCs单独培养组(0.117±0.007)增高；且SCs共培养后的BMSCs组亦较OECs共培养后的BMSCs组高,均有统计学意义(p<0.05)；4.2 OECs共培养后的HSCs组(0.197±0.029)和SCs共培养后的HSCs组(0.339±0.089)的细胞MTT检测值均较HSCs单独培养组(0.167±0.016)明显增高,且SCs共培养后的HSCs组亦较OECs共培养后的HSCs组高,均有统计学意义(p<0.05)；4.3 OECs共培养后的NSCs组(0.249±0.018)和SCs共培养后的NSCs组(0.197±0.020)的细胞MTT检测值均较NSCs单独培养组(0.160±0.012)增高,且OECs共培养后的NSCs组亦较SCs共培养后的NSCs组高,均有统计学意义(p<0.05)。5、IHC染色分化指标：5.1 BMSCs各组ICH染色结果：分化指标β-TubulinⅢNF、Neun、Galc、GFAP的IHC染色显示：SCs共培养后的BMSCs组β-TubulinⅢ(10.1±3.3%)、Neun (18.3±8.9%)、NF(7.6±5.3%)阳性细胞百分数均较OECs共培养后的BMSCs组(7.5±2.4%、12.3±4.3%、2.4±1.3%)和BMSCs单独培养组(6.9±3.7%、12.6±±5.1%、0.0±0.0%)明显增多,其差异有统计学意义(p<0.05)；OECs共培养后的BMSCs组仅NF阳性百分数较BMSCs单独培养组多,其差异有统计学意义(p<0.05),而两组间β-TubulinⅢNeun阳性百分数差异无统计学意义(P>0.05)；BMSCs单独培养组、OECs共培养后的BMSCs组及SCs共培养后的BMSCs组Galc染色均呈阳性,测得三组灰度值比较显示SCs共培养后的BMSCs组(0.29±0.04)和OECs共培养后的BMSCs组(0.28±0.04)灰度值均较BMSCs单独培养组(0.26±0.04)增高,其差异有统计学意义(P<0.05),而SCs共培养后的BMSCs组和OECs共培养后的BMSCs组两组间差异无统计学意义(P>0.05)；BMSCs单独培养组、OECs共培养后的BMSCs组及SCs共培养后的BMSCs组三组GFAP染色均呈阴性。5.2HSCs各组IHC染色结果：SCs共培养后的HSCs组β-TubulinⅢ(94.0±2.2%)、Neun (92.2±3.3%)、NF(95.0±1.6%)、Galc(96.4±1.4%)、GFAP (91.9±2.6%)阳性细胞百分数和OECs共培养后的HSCs组β-TubulinⅢ(94.5±1.7%)、Neun (94.6±2.2%)、NF (94.8±2.2%)、Galc (96.3±1.8%)、GFAP (94.8±2.1%)阳性细胞百分数均较HSCs单独培养组(43.9±8.0%、49.8±9.3%、50.5±7.3%、58.7±4.2%、39.1±5.2%)明显增多,其差异有统计学意义(p<0.05),而OECs共培养后的HSCs组与SCs共培养后的HSCs组间其差异无统计学意义(P>0.05)。5.3NSCs各组IHC染色结果：SCs共培养后的NSCs组Neun(46.7±8.8%)、NF(44.5±11.9%)阳性细胞百分数和OECs共培养后的NSCs组Neun(31.5±7.5%)、NF(35.2±5.5%)阳性细胞百分数均较NSCs单独培养组(24.6±6.0%、28.3±7.8%)明显增多,其差异有统计学意义(p<0.05),而OECs共培养后的NSCs组与SCs共培养后的NSCs组间其差异亦均有统计学意义(p<0.05)；OECs共培养后的NSCs组β-TubulinⅢ(85.1±7.1%)阳性细胞百分数较NSCs单独培养组(75.6±13.5%)明显增多,其差异有统计学意义(p<0.05),而SCs共培养后的NSCs组β-TubulinⅢ(40.7±7.8%)阳性细胞百分数较NSCs单独培养组明显减少,其差异有统计学意义(p<0.05),且OECs共培养后的NSCs组和SCs共培养后的NSCs组间比较亦有显著差异(p<0.05)；SCs共培养后的NSCs组Galc (22.9±9.9%)、GFAP (15.7±10.7%)阳性细胞百分数和OECs共培养后的NSCs组Galc (21.7±7.8%)、GFAP(18.6±7.2%)阳性细胞百分数均较NSCs单独培养组(43.8±16.5%、33.4±15.8%)减少,其差异有统计学意义(p<0.05),而OECs共培养后的NSCs组与SCs共培养后的NSCs组间其差异无统计学意义(P>0.05)。6、RT-PCR检测：6.1 BMSCs各组营养因子及受体表达情况：SCs共培养后的BMSCs组和OECs共培养后的BMSCs组营养因子BDNF、CNTF、IGF-1、NGF、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、VEGF及受体TrkC表达与BMSCs单独培养组比较无明显差异(p>0.05)；而OECs共培养后的BMSCs组TrkB(0.71±0.19)表达较对照组BMSCs单独培养组(0.43±0.21)增加,差异有统计学意义(p=0.039,<0.05)；SCs共培养后的BMSCs组TrkA(0.14±0.13)表达较对照组BMSCs单独培养组(0.37±0.20)减少,差异有统计学意义(p=0.034,<0.05)。6.2 NSCs各组营养因子及受体表达情况：OECs共培养后的NSCs组、SCs共培养后的NSCs组及NSCs单独培养组三组间CNTF、IGF-1、TGF-β1、TGF-β2、TrkA表达无明显差异(p>0.05)；而OECs共培养后的NSCs组和SCs共培养后的NSCs组BDNF (0.09±0.07, 0.22±0.13)、NGF (0.24±0.12,0.61±0.31)、PDGF (0.07±0.08,0.13±0.06)、TrkB(0.32±0.13,0.51±0.11)表达较NSCs单独培养组(0.69±0.46,1.46±0.37,0.44±0.16,1.05±0.44)均减少,差异均有统计学意义(p<0.05)；OECs共培养后的NSCs组VEGF(0.16±0.10)表达较NSCs单独培养组(0.26±0.05)亦减少,差异有统计学意义(p<0.05)；而SCs共培养后的NSCs组TrkC(0.71±0.15)表达较NSCs单独培养组(0.54±0.12)增加,差异有统计学意义(p=0.017<0.05)；6.3 HSCs各组营养因子及受体表达情况：OECs共培养后的HSCs组、SCs共培养后的HSCs组及HSCs单独培养组三组间TrkA表达无明显差异(p>0.05)；SCs共培养后的HSCs组BDNF (0.93±0.15、CNTF (0.61±0.28)、PDGF(0.64±0.50)、TGF-β1 (1.53±0.25)、TGF-β2 (1.01±0.45)、VEGF (0.19±0.15)及TrkB (1.26±0.33)、TrkC(0.81±0.49)表达较HSCs单独培养组(0.30±0.23,0.09±0.09,0.16±0.15,0.95±0.11,0.26±0.23,0.06±0.04,0.58±0.60,0.26±0.10)增加,其差异均有统计学意义(p<0.05)；而OECs共培养后的HSCs组仅IGF-1(1.30±0.15)表达较HSCs单独培养组(0.98±0.10)增加,其差异有统计学意义(p=0.012,<0.05)；OECs共培养后的HSCs组NGF(0.72±0.13)表达较HSCs单独培养组(1.23±0.19)减少,其差异有统计学意义(p=0.01,<0.05)。[结论]1、OECs和SCs明显促进BMSCs、HSCs及NSCs的增殖和存活,且SCs对BMSCs、HSCs的影响较OECs更明显；而SCs、OECs对NSCs的影响各异,SCs对NSCs神经球大小的影响较OECs明显,对NSCs增殖和活力的影响较OECs弱。2、OECs和SCs均明显促进BMSCs、HSCs及NSCs的分化,且SCs和OECs明显促进BMSCs向神经元方向分化,基本上不向星形胶质细胞分化；SCs和OECs对HSCs向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化都有明显促进作用,且各分化趋势间无明显差异；SCs和OECs明显促进NSCs向神经元方向分化,而明显抑制星形胶质细胞和少突胶质细胞分化,且SCs对NSCs向神经元方向分化的影响较OECs更明显,但SCs和OECs对NSCs向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的影响无明显差异。3、SCs抑制了BMSCs表达TrkA, OECs促进了BMSCs表达TrkB增加；OECs、SCs均抑制了NSCs表达BDNF、NGF、PDGF、TrkB, OECs亦抑制了NSCs表达VEGF,而SCs促进了NSCs表达TrkC增加；SCs促进了HSCs表达BDNF、CNTF、PDGF、TGF-βl、TGF-β2、VEGF、TrkB、TrkC增加,而OECs促进了HSCs表达IGF-1增加,抑制了HSCs表达NGF。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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