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氯氰菊酯免疫毒性机制的初步研究

作　者: 刘喜平
导　师: 熊丽
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 氯氰菊酯免疫调节钙调磷酸酶
分类号: S482.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

拟除虫菊酯是有机磷、有机氯等化学合成杀虫剂的替代产品，目前被广泛使用。而且大量被用于室内卫生杀虫，人类面临着拟除虫菊酯的暴露风险日益增大，因而对其进行全面的安全性评价非常必要。以往的研究多集中在其神经毒性上，对其免疫毒性关注较少。氯氰菊酯是拟除虫菊酯的代表，除了作杀虫用途以外还有其特点。即在研究中，氯氰菊酯与免疫抑制药物环孢菌素A（CsA）和他可莫司（FK506）一样，可被用作钙调磷酸酶的特异性抑制剂。而钙调磷酸酶在免疫相关的多条信号通路激活中发挥重要作用，因此选择氯氰菊酯作为研究对象，有可能较深入地揭示拟除虫菊酯的免疫毒性机制。因为鱼类是较低等的脊椎动物，在先天性免疫研究中有独特作用；而且鱼类较其它动物对拟除虫菊酯更为敏感。而斑马鱼又是OECD标准化的评价外源化合物毒性的实验动物，因此本研究中使用斑马鱼作为实验动物。用氯氰菊酯对斑马鱼染毒，观察其急性毒性，确定氯氰菊酯半数致死浓度位于10μg/L～18μg/L之间。使用相对定量RT-PCR方法研究氯氰菊酯96h染毒后，nfat信号途径和wnt信号途径上相关分子的转录相对水平。并使用gsk3β的激酶活性阻断剂Li⁺单独或与氯氰菊酯合并染毒，用同样方法研究其转录变化。结果显示Li₂CO₃溶于饲养水单独作用能抑制斑马鱼gsk3β的转录，与Li⁺作为gsk3β激酶活性高效抑制剂的结果一致。氯氰菊酯单独染毒后，rcan1和il-1β转录都有上调。而Li₂CO₃与氯氰菊酯合并染毒上调il-1β转录的程度较二者单独作用高，在一定程度显示加合效应。与预期不符的是，氯氰菊酯对il-1β的转录上调。因此氯氰菊酯的免疫调节效应可能不是通过其对CaN的抑制发生的，而更可能与氯氰菊酯造成的细胞内Ca₂⁺浓度升高相关。而且Li₂CO₃直接对斑马鱼染毒，也能产生与对培养细胞作用一致的gsk3β阻断作用。氯氰菊酯染毒也能显著诱导wnt10b的转录。以上结果提示，氯氰菊酯对斑马鱼的免疫毒性机制中，可能通过Ca₂⁺和gsk3β等关键成员，整合nfat和Wnt两种信号途径。然而因为鱼类免疫相关蛋白的研究较少，大部分斑马鱼免疫相关蛋白和抗体还未商品化；而且与高等脊椎动物的交叉反应性小，来源于常见实验动物的抗体和细胞因子等不能在斑马鱼中使用，因而研究主要集中在转录水平。但是本研究仍然对氯氰菊酯的免疫调节机制进行了初步研究；待条件成熟后有望对其进行深入研究。

全文目录

中文摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
缩略词表  7-8
目录  8-10
引言  10-31
  1.1 氯氰菊酯免疫毒性及检测  10-15
    1.1.1 氯氰菊酯毒性概述  10-11
    1.1.2 氯氰菊酯的免疫毒性研究概况  11-12
    1.1.3 免疫毒性的检测方法  12-15
  1.2.氯氰菊酯与钙调磷酸酶(CAN)介导的信号通路  15-25
    1.2.1 钙调磷酸酶及其介导的信号通路  15-18
    1.2.2 钙调磷酸酶介导信号通路的调节  18-22
    1.2.3 氯氰菊酯对钙调磷酸酶的专一性抑制  22-23
    1.2.4 CaN-NFAT信号通路与免疫  23-25
  1.3 CAN-NFAT信号途径与其它信号通路的交互作用(CROSS-TALK)  25-30
    1.3.1 NFAT信号与其它信号途径交互作用的机制  26
    1.3.2 Notch信号通过下调RCAN1以增强CaN-NFAT信号  26-27
    1.3.3 Wnt信号与NFAT信号的整合  27-30
  1.4 氯氰菊酯免疫调节机制的假设及本研究的意义  30-31
材料和方法  31-36
  2.1 实验材料  31-32
    2.1.1 实验动物  31
    2.1.2 化学试剂及配制  31
    2.1.3 实验仪器设备  31-32
  2.2 实验方法  32-36
    2.2.1 氯氰菊酯对斑马鱼染毒  32
    2.2.2 实验器材的处理  32
    2.2.3 RNA提取操作步骤  32-33
    2.2.4 总RNA的定量和完整性检验  33
    2.2.5 引物设计合成与稀释分装  33-34
    2.2.6 二步法RT-PCR实验  34
    2.2.7 PCR产物的半定量检测  34-35
    2.2.8 使用Li_2CO_3作用于斑马鱼  35
    2.2.9 氯氰菊酯和Li_2CO_3共同作用于斑马鱼  35-36
结果  36-41
  3.1 氯氰菊酯实验浓度的确定  36
  3.2 总RNA的提取  36
  3.3 氯氰菊酯对斑马鱼免疫组织中NFAT信号通路相关分子转录的影响  36-37
  3.4 氯氰菊酯对斑马鱼免疫组织中WNT信号通路相关分子转录的影响  37-39
  3.5 Li_2CO_3对斑马鱼免疫组织GSK3B转录水平的影响  39-40
  3.6 氯氰菊酯和Li_2CO_3共同作用对斑马鱼的影响  40-41
结论与讨论  41-46
  4.1 实验结果的解释及结论  41
  4.2 氯氰菊酯与FK506,CsA结构比较及可能的免疫抑制机制  41-44
  4.3 斑马鱼作为免疫学研究实验动物的特色及缺陷  44-45
  4.4 存在的问题及未来工作展望  45-46
参考文献  46-57
在校期间发表的论文  57-58
致谢  58

氯氰菊酯免疫毒性机制的初步研究

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