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ABT-737与雷公藤红素联合抗肿瘤活性的机制研究

作　者: 杨溦
导　师: 何俏军；杨波
学　校: 浙江大学
专　业: 药学
关键词: ABT-737 Celastrol 协同 凋亡 NOXA
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：探讨和研究雷公藤红素(Celastrol)和ABT-737联合应用对人肝癌细胞Bel-7402和HepG2凋亡的影响及其作用机制。方法：1.MTT法检测ABT-737和雷公藤红素(Celastrol)单用及合用人肝癌细胞Bel-7402和HepG2的细胞存活率,并采用软件CalcuSyn计算CI值；2.DAPI染色观察ABT-737和雷公藤红素(Celastrol)作用后,细胞凋亡小体的产生；3.PI染色结合流式细胞术检测ABT-737和雷公藤红素(Celastrol)作用后细胞凋亡率的变化；4.JC1染色观察ABT-737和雷公藤红素(Celastrol)作用后,线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)的变化；5. Western blotting法检测ABT-737和雷公藤红素(Celastrol)作用后,凋亡相关蛋白,Hsp90客户蛋白,NOXA等关键蛋白的含量变化；6. real-time RT-PCR法检测雷公藤红素(Celastrol)作用后,细胞NOXA基因转录水平的变化；7.小分子RNA干扰技术敲除ATF4,观察雷公藤红素(Celastrol)作用后,细胞NOXA基因转录水平的变化；8.小分子RNA干扰技术敲除NOXA,观察ABT-737和雷公藤红素(Celastrol)作用后,细胞凋亡和细胞存活率的变化；9.免疫共沉淀法观察ABT-737和雷公藤红素(Celastrol)作用后,NOXA蛋白与Mcl-1蛋白的结合情况。结果：1.ABT-737和雷公藤红素不同浓度均具有协同抑制人肝癌细胞Bel-7402和HepG2生长的作用,合用CI值均小于0.7,具有协同作用；DAPI染色结果显示,Bel-7402和HepG2细胞给药72 h以后,10μMABT-737和1.25μM雷公藤红素单用组与对照组相比无明显凋亡小体的产生,而合用组细胞染色质发生聚缩、并形成凋亡小体；3.PI单染结合流式细胞术检测凋亡率的结果显示,Bel-7402和HepG2细胞给药24 h、48 h、72 h后,10μMABT-737和1.25μM雷公藤红素合用组与两药单用组相比较,细胞凋亡率均有显著性差异,呈时间依赖性关系增加；2.JC-1染色观察细胞线粒体膜电位变化,Bel-7402和HepG2细胞给药24 h后,10μMABT-737和1.25μM雷公藤红素单用组细胞与对照组细胞相比未呈现明显绿色荧光,两药合用组可使细胞呈现大量绿色荧光(即△Ψm降低)；Bel-7402和HepG2细胞给药6、12、24 h后,ABT-737和雷公藤红素合用组可使细胞呈现时间依赖性的线粒体膜电位降低；提取胞浆蛋白检测细胞质中细胞色素C含量,实验结果显示,10μM ABT-737和1.25μM雷公藤红素合用,与单用组相比,能够明显促进HepG2细胞的细胞色素C释放至细胞质；western blotting结果显示,10μMABT-737和1.25μM雷公藤红素合用,与单用组相比,能够明显促进Bel-7402和HepG2细胞内caspase-3的断裂和PARP的裂解；3. western blotting结果显示,1.25、2.5、5μM雷公藤红素能够诱导Bel-7402和HepG2细胞内Ub上调,HSP90客户蛋白p-ERK, CDK4降解,HSP70蛋白累积,具有HSP抑制活性；western blotting和RT-PCR结果显示,1.25、2.5、5μM雷公藤红素能够引发内质网应激反应,诱导HepG2细胞内p-eIF2a和ATF4上调,并且上调NOXA mRNA表达；小分子RNA干扰技术,western blotting和RT-PCR结果显示,HepG2细胞敲除ATF4基因以后,与未敲除的细胞相比,雷公藤红素上调NOXA mRNA表达的作用明显减弱；4.western blotting结果显示,1.25μM雷公藤红素单用,10μMABT-737和1.25μM雷公藤红素共同作用,均能够诱导Bel-7402和HepG2细胞内NOXA上调,且该上调作用的发生早于细胞凋亡；小分子RNA干扰技术、western blotting和MTT结果显示,HepG2细胞敲除NOXA基因以后,与未敲除的细胞相比,雷公藤红素和ABT-737诱导细胞发生caspase-3断裂和PARP裂解的作用明显减弱,对细胞的生长抑制作用也被取消；5.免疫共沉淀法结果显示,1.25μM雷公藤红素单用,10μM ABT-737和1.25μM雷公藤红素共同作用,均能够促进NOXA与Mcl-1的蛋白结合。结论：ABT-737和雷公藤红素能够协同诱导肿瘤细胞发生线粒体通路的细胞凋亡,其具体机制为雷公藤红素通过其HSP90抑制作用,引发内质网应激反应从而上调NOXA;上调的NOXA能与细胞内Mcl-1结合释放Bak,引起线粒体膜通透的改变,释放线粒体的细胞色素C,启动caspase级联通路从而诱导细胞发生凋亡

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