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重组红火蚁毒素蛋白SoliⅣ致病机理的初步研究

作　者: 王建峰
导　师: 张书霞；林祥梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 红火蚁致病机理过敏反应重组红火蚁毒素蛋白SoliⅣ
分类号: R384
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

红火蚁属节肢动物门昆虫纲,是一种外来入侵害蚁,被认为是严重卫生公害。被红火蚁螫伤后,一些红火蚁毒素蛋白能引起人的过敏反应甚至死亡。本文用重组表达的红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ注射兔子做为动物模型,来研究重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ致病机理。本实验在国内首次利用大肠杆菌表达红火蚁重组毒素蛋白Sol iⅣ。诱导表达菌经超声波破碎,表达产物存在于上清液,红火蚁重组毒素蛋白Ⅳ在表达工程菌BL-21中为可溶性表达。用镍层析树脂纯化超声波破菌后的上清液,得到的高纯度蛋白。通过注射小鼠和兔子进行蛋白活性试验,选出合适的动物模型,发现兔子要比小鼠敏感,有40%左右的兔子出现过敏。再通过蛋白皮试试验选择敏感动物,进行蛋白免疫治疗试验,发现通过小剂量多次注射该蛋白,能起到免疫治疗效果。通过分离兔外周血淋巴细胞进行培养,经不同浓度的重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ分别和细菌脂多糖(LPS)、刀豆蛋白(ConA)共同刺激后,MTT法测定淋巴细胞的增殖情况,重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ浓度为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和LPS共刺激时,与单独LPS刺激的对照组比较,淋巴细胞增殖活性显著增高(P＜0.05);浓度为15μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和ConA共刺激时,与单独ConA刺激的对照组比较,淋巴细胞增殖活性显著增高(P＜0.05)。通过兔子的致敏实验,观察受试兔子的皮肤、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、等组织的组织病理变化,皮肤:真皮层发生坏死,坏死灶周围出现大量的嗜酸性粒细胞和炎性细胞。肝脏:肝细胞内可见水泡变性和颗粒变性,肝窦内出现大量嗜酸性粒细胞。肺脏:肺泡壁毛充血,肿胀,肺泡壁内有多量嗜酸性粒细胞。进一步通过ELISA和荧光定量RT-PCR方法检测过敏兔子血清和组织中的IgE和细胞因子,IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-10变化。结果显示血清中IL-4、总IgE和IL-10的水平升高,IL-4和IL-10在14h左右达到最高值,总IgE在20 h达到峰值。IFN-γ的水平降低,在20 h达到最低值,IL-6的水平没有显著的变化。重组毒素蛋白Sol iⅣ注射后32 h,实验组兔脾脏和淋巴结中除IL-6 mRNA外,IL-4和IL-10 mRNA量均极显著高于对照组兔(P＜0.01),IFN-γ则极显著低于对照组兔(P＜0.01)。实验组兔脾脏中IL-4 mRNA的表达量是对照组兔的8.3倍,IL-10 mRNA的表达量是对照组的7.2倍,而IFN-γmRNA的表达量只有对照组兔的13.4%;淋巴结中,实验组兔IL-4 mRNA的表达量是对照组兔的6倍,IL-10 mRNA实验组兔是对照组兔的16.4倍,IFN-γmRNA的表达量只有对照组兔的12.8%;而IL-6mRNA对照组和实验组均没有统计学差异结论一定浓度的重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ能引起体外培养的T、B淋巴细胞增殖,过敏体质兔在重组红火蚁毒素蛋白Sol iⅣ刺激后能引起Ⅰ型变态反应。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
符号说明  10-11
第一篇文献综述  11-23
  一红火蚁  13-17
    1 红火蚁的介绍  13-15
      1.1 学名:  13
      1.2 分类地位:  13
      1.3 分布:  13-15
    2 红火蚁的危害  15-17
      2.1 对公共卫生安全的威胁  15-16
      2.2 对农业生产的威胁  16-17
      2.3 对经济的威胁  17
  二过敏反应  17-20
  三红火蚁毒液研究进展  20-23
    1 生物碱的研究  20-21
    2 毒蛋白的研究进展  21-23
第二篇试验研究  23-63
  第一章重组红火蚁毒素蛋白SoliⅣ的表达与纯化  25-31
    1 材料与方法  25-27
      1.1 质粒与菌种  25
      1.2 主要试剂和仪器  25
      1.3 蛋白诱导表达  25-26
      1.4 表达蛋白的纯化  26
      1.5 SDS-PAGE电泳  26-27
      1.6 Western blot  27
    2 结果  27-29
      2.1 蛋白的诱导结果  27
      2.2 蛋白纯化结果  27-28
      2.3 Western blot结果  28-29
    3 讨论  29-31
  第二章重组红火蚁毒素蛋白SoliⅣ致病性研究  31-40
    1 材料与方法  31-34
      1.1 实验动物  31
      1.2 主要试剂和仪器  31
      1.3 表达蛋白的活性试验:  31-32
      1.4 蛋白皮试与免疫治疗试验:  32-33
      1.5 病理组织学检查  33-34
    2 结果  34-37
      2.1 蛋白活性试验结果  34
      2.2 蛋白实验和免疫治疗实验结果  34-35
      2.3 组织病理变化结果  35-37
    3 讨论  37-40
  第三章重组红火蚁毒素蛋白SoliⅣ致病机理的初步研究  40-63
    1 材料与方法  40-46
      1.1 试验动物与试验设计  40
      1.2 采样及样品保存  40
      1.3 主要试剂和仪器  40-41
      1.4 重组红火蚁毒素蛋白SoliⅣ对兔体外淋巴细胞增殖功能的影响  41-42
      1.5 血清中IgE、IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-10的测定  42
      1.6 荧光定量PCR测定细胞因子mRNA  42-46
      1.7 统计学处理  46
    2 结果  46-60
      2.1 SoliⅣ淋巴细胞转化率的影响  46-48
      2.2 血清中细胞因子含量的变化  48-51
      2.3 重组质粒PCR鉴定结果  51-52
      2.4 序列比较  52-55
      2.5 细胞因子mRNA荧光定量RT-PCR结果  55-60
    3 讨论  60-63
参考文献  63-67
全文总结  67-68
附录主要试剂配制  68-70
致谢  70-71
论文发表情况  71

重组红火蚁毒素蛋白SoliⅣ致病机理的初步研究

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