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玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究

作 者: 季丽丽
导 师: 王丕武
学 校: 吉林农业大学
专 业: 作物生物技术
关键词: HrpZ基因 过敏反应 外植体 遗传转化
分类号: S513
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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引 用: 1次
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内容摘要


HrpZ基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的蛋白激发因子,它能引起非寄主植物的过敏性反应(hypersensitive response, HR),表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡,这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。HR反应后,植物体内出现了一系列的防反应,如强化结构屏障作用,合成裂解酶或者产生植物抗毒素,具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广,极类似于“系统获得性抗性”(systematic acquired resistnace SAR)。玉米(Zea may L.)是世界上重要的粮食、饲料作物,也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。产量居农作物之首,也是重要的遗传模式植物。长期以来,玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国,玉米生产在国民经济中占有非常重要的地位。然而,生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素,传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术进行玉米遗传改良,增强玉米抗病虫和耐逆境能力,提高产量,改善品质,是玉米遗传育种的一个新方向。因此,玉米的基础研究和遗传改良具有重大的理论和现实意义。为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系,本文分别以玉米幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导,较系统地研究了常规优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系,并对转化株进行了PCR检测,获得了如下主要结果:1.选用了生产上广泛应用的10个玉米优良自交系,通过组织培养研究其愈伤诱导及植株再生情况,并优化了玉米愈伤诱导及再生的条件,为开展转基因育种提供了技术基础。结果表明,玉米自交系基因型间的培养能力具有较大的差异,10个玉米自交系幼胚都能诱导出初级愈伤组织,但是形成胚性愈伤组织的能力上具有很大的差异,其中仅6个自交系:H99,丹988,铁7922,1322,7319和PH4CV能形成胚性愈伤组织;以实验室多年来筛选的优良自交系H99,丹988和铁7922的幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体诱导愈伤,实验证明,根尖和幼叶只能诱导出初级愈伤。三个基因型中仅丹988的幼胚,成熟胚,茎尖能够诱导出胚性愈伤组织,可见丹988为愈伤诱导的优良自交系。此外,适当浓度的6-BA仅能提高茎尖的愈伤诱导率,培养基种类,胚龄,4℃冷存时间,不同附加物KT,CaCl2, AgNO3的添加对幼胚来源的愈伤也有一定的影响。2.采用正交试验法,选用丹988的茎尖来源幼胚为受体材料,以pCAMBIA1301-HrpZpsta和PCAMBIA3301-HrpZpsta为表达载体,对农杆菌转化中的菌液OD值、侵染时间、共培养时间和AS浓度四因素进行了优化。确定了农杆菌介导的转化体系的最优条件为菌液OD值0.6、浸染时间20mi n、共培养时间2d和AS浓度300μmol/L。此外,鉴定了H99和月988的玉米愈伤组织耐盐碱敏感性和抗草胺磷敏感性,确定玉米愈伤组织盐和草胺磷临界浓度;茎尖来源的愈伤组织的抗性愈伤率,再生率及转化率均略高于幼胚,显著高于成熟胚。将含有HrpZ基因的重组质粒经农杆菌介导法转化玉米愈伤,经PCR检测共获得H99抗盐植株18株,抗草胺磷植株10株,丹988抗盐植株12株,抗草胺磷植株5株。但并未收获T1代果实。3.对花粉管通道法的外源DNA导入时期和浓度进行了探讨,仅获得丹988的两棵转基因植株。花粉管通道法虽然转化效率比较低,但可避开组织培养继代繁琐、再生植株移栽成活较难等障碍,仍不失为一种良好的方法。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章 前言  10-26
  1.1 HrpZ基因概述  10-13
    1.1.1 Hrp基因  10-11
    1.1.2 Ⅲ型分泌系统及Ⅲ型效应分子  11-12
    1.1.3 HrpZ基因  12-13
  1.2 玉米遗传转化的研究进展  13-23
    1.2.1 玉米的应用价值  13
    1.2.2 玉米遗传转化研究概述  13-15
    1.2.3 受体系统  15-17
    1.2.4 遗传转化方法  17-23
  1.3 研究目的和意义  23-25
  1.4 研究的主要内容  25-26
第二章 玉米不同外植体愈伤的诱导  26-40
  2.1 供试材料  26-27
    2.1.1 材料  26
    2.1.2 培养基  26
    2.1.3 培养材料的处理  26-27
    2.1.4 观察和统计方法  27
  2.2 实验方法  27-28
    2.2.1 幼胚愈伤组织的诱导  27-28
  2.3 玉米成熟胚,茎尖,根尖及幼叶愈伤的诱导  28
    2.3.1 培养基对愈伤组织诱导的影响  28
    2.3.2 2,4-D浓度对愈伤诱导的影响  28
  2.4 植株再生  28-29
    2.4.1 不同外植体来源的愈伤分化及再生能力比较  28
    2.4.2 不同激素的对成熟胚愈伤分化的影响  28-29
  2.5 结果与分析  29-37
    2.5.1 幼胚愈伤诱导  29-31
    2.5.2 成熟胚愈伤的诱导  31-32
    2.5.3 茎尖愈伤的诱导  32-33
    2.5.4 根尖和幼叶愈伤的诱导  33
    2.5.5 不同基因型愈伤诱导比较  33-35
    2.5.6 不同外植体愈伤诱导比较  35-36
    2.5.7 植株再生性比较  36-37
  2.6 讨论  37-40
    2.6.1 培养基对玉米愈伤组织诱导率的影响  37
    2.6.2 外源激素对玉米愈伤组织诱导率的影响  37-38
    2.6.3 基因型对玉米愈伤组织诱导率及分化的影响  38
    2.6.4 不同外植体对愈伤诱导率的影响  38
    2.6.5 影响幼胚愈伤诱导的其他因素  38-40
第二章 常用溶液试剂配制及基本实验方法  40-48
  3.1 常用溶液及试剂的配制  40-42
    3.1.1 常用培养基的配制  40-41
    3.1.2 常用溶液的配置  41-42
  3.2 基本实验方法  42-48
    3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)  42-43
    3.2.2 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞  43
    3.2.3 质粒DNA的提取(碱裂解法)  43-45
    3.2.4 农杆菌感受态细胞的制备  45
    3.2.5 质粒DNA直接转化农杆菌  45
    3.2.6 玉米总DNA的提取(CTAB法)  45-46
    3.2.7 琼脂糖凝胶电泳  46
    3.2.8 DNA片段的回收和纯化  46-48
第四章 HrpZ基因在玉米中的遗传转化  48-61
  4.1 农杆菌介导法的遗传转化  48-51
    4.1.1 材料  48-50
    4.1.2 实验方法  50-51
  4.2 花粉管介导法的遗传转化  51-53
    4.2.1 材料  51-52
    4.2.2 实验方法  52-53
  4.3 实验结果与分析  53-58
    4.3.1 玉米愈伤选择压的确定  53-54
    4.3.2 农杆菌介导的遗传转化  54-56
    4.3.3 花粉管介导的遗传转化  56
    4.3.4 转基因植株的PCR检测  56-58
  4.4 讨论  58-61
    4.4.1 农杆菌介导的转化  58-59
    4.4.2 花粉管介导法  59-61
第五章 结论  61-62
参考文献  62-75
附录  75-76
致谢  76-77
作者简历  77

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 玉米(玉蜀黍)
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