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锯缘青蟹内表皮N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质研究

作　者: 颜雅雯
导　师: 陈清西
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 锯缘青蟹几丁质酶 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶效应物不同生长期不同季节
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

以锯缘青蟹（Scylla serrata）内表皮为材料,经过含0.2 mol/L NaCl的10 mmol/LTris-HCl（pH 7.5）缓冲液匀浆抽提处理,硫酸铵分级盐析纯化,获得粗酶。粗酶再经过SephadexG-100凝胶层析,DEAE-Cellulose离子交换柱层析,Phenyl Sepharose柱层析,及ConA Sepharose柱层析,获得比活为668.90 U/mg的聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-Acetyl-β-D-glucosaminidase或NAGase,EC 3.2.1.52）制剂。通过Sephacryl-S 200凝胶过滤柱层析法测定该酶的分子量约为74.59 kD。该酶为糖蛋白。进一步对锯缘青蟹内表皮NAGase进行研究。化学修饰法研究表明:组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基和酸性氨基酸的侧链羧基是该酶的活性功能基团,而二硫键、赖氨酸的ε-氨基和精氨酸胍基不是该酶所必需的。分别选用水体污染物（金属离子和有机溶剂）、饲料成分（氨基酸和糖）及抗菌类药物为效应物,探讨这些物质对内表皮NAGase活力的影响。1.金属离子对酶活力的影响:结果表明Mg²⁺对酶活力几乎没有影响;Co²⁺和Mn²⁺分别在1.0-10.0 mmol/L和0.5-20.0 mmol/L浓度范围对酶有轻微的激活作用;Al³⁺对酶有一定的抑制作用,当其浓度为0.54 mmol/L时,可抑制44.4%的活力;而Pb⁺、Cu²⁺和Zn²⁺对酶具有强烈的抑制作用,其半抑制浓度(IC₅₀)分别为:0.4、0.05和0.04mmol/L。2.有机溶剂对酶活力的影响:结果表明甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、丙酮、甲醛、二甲亚砜、二氧六环及二甲基甲酰胺等对酶均有较强的抑制作用,其半抑制浓度(IC₅₀)分别为:3.7、2.3、1.15、2.4、2、2.3、0.80、1.15、0.68、0.88和0.8mol/L。3.氨基酸对酶活力的影响:结果表明除L-Lys具有明显的抑制作用,L-His和L-Asp具有轻微的抑制作用外,其余的几种氨基酸对该酶均无明显的影响。导致该酶活力丧失一半的L-Lys浓度(IC₅₀)为11 mmol/L。4.糖对酶活力的影响:结果表明当鼠李糖（rha）的浓度达0.2 mol/L,可激活酶活力约15%;0.8 mol/L的果糖（fru）、蔗糖（suc）、葡萄糖（glvu）和甘露糖（man）分别使酶的活力下降47.61%、57.54%、85.70%和90.50%;0.6 mol/L的阿拉伯糖（ara）可抑制酶41.62%的活力;0.09 mol/L的葡萄糖醛酸（glcUA）可使酶活力基本丧失;0.3 mol/L的半乳糖（gal）可抑制酶活力37.71%;而80 mmol/L的NAG可使酶丧失83%的活力。5.抗菌类药物对酶活力的影响:结果表明青霉素钾、卡那霉素和链霉素对酶活力基本没有影响;1.0-10.0 mg/ml的庆大霉素对酶有轻微的激活作用;而恩诺沙星对酶有强烈的抑制作用,使酶活力丧失一半的浓度(IC₅₀)为2.9 mg/ml。分别以锯缘青蟹的内表皮和肝胰脏为材料,通过匀浆、离心,获chtitnase和NAGase粗酶液。通过对不同生长期锯缘青蟹chitinase和NAGase的比较研究,结果显示不同生长期锯缘青蟹内表皮的chitinase和NAGase的比活力变化趋势基本一致:比活力在第1期最高,然后依次递减,第5期达到最低,此后维持在一稳定的水平。而肝胰脏chitinase和NAGase的比活力变化趋势虽然基本一致,但并没有一定的变化规律。内表皮和肝胰脏的NAGase最适pH都在5.6-5.8,最适温度分别为42℃和40±2℃,pH稳定性分别是5.0-10.0和5.0-9.0。温度稳定性方面的研究表明内表皮NAGase在大于45℃的条件下活力逐渐丧失,肝胰腺NAGase在大于42℃。的条件下活力开始降低。通过对不同季节锯缘青蟹chitinase和NAGase的比较研究,结果表明:锯缘青蟹内表皮chitinase和NAGase活力表现一致的季节性变化趋势,活力较高的月份集中在10-12月;一年当中,3月的活力较低,此后活力逐渐升高,直至11月,活力达到最高,然后又逐渐减小。不同季节肝胰脏chitinase和NAGase的活力变化规律与与内表皮的相似。不同季节NAGase的基本酶学性质较稳定,内表皮和肝胰腺的NAGase最适pH都在5.6-5.8,最适温度分别为42℃和40±2℃,pH稳定性分别是5.0-10.0和5.0-9.0。温度稳定性方面的研究表明内表皮NAGase在大于45℃的条件下活力逐渐丧失,肝胰腺NAGase在大于42℃。的条件下活力开始降低。

全文目录

中文摘要  12-14
英文摘要  14-17
缩略词  17-19
第一章引言  19-29
  1.1 锯缘青蟹的概况  19-22
    1.1.1 生活习性  19-20
    1.1.2 繁殖与发育  20-22
    1.1.3 锯缘青蟹养殖现状与存在的问题  22
  1.2 几丁质和几丁质酶系  22-28
    1.2.1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶简介  24-25
    1.2.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的生理功能  25-26
    1.2.3 甲壳动物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究情况  26-28
  1.3 本课题的研究内容与研究意义  28-29
第二章实验材料、仪器与方法  29-39
  2.1 材料与试剂  29-30
  2.2 仪器  30
  2.3 方法  30-39
    2.3.1 锯缘青蟹和组织的获得  30-32
    2.3.2 蛋白质浓度的测定  32
    2.3.3 NAGase活力的测定和比活的计算  32-33
    2.3.4 Chitinase活力的测定和比活的计算  33
    2.3.5 内表皮NAGase的分离纯化  33-35
    2.3.6 内表皮NAGase的纯度鉴定  35-36
    2.3.7 内表皮NAGsae分子量的测定  36
    2.3.8 表皮NAGase的化学修饰  36-37
    2.3.9 水体污染物对内表皮NAGase活力的影响  37
    2.3.10 饲料成分对内表皮NAGase活力的影响  37
    2.3.11 抗菌类药物对内表皮NAGase活力的影响  37
    2.3.12 NAGase催化反应的动力学性质研究  37-39
      2.3.12.1 NAGase催化pNP-NAG水解的动力学参数测定  37
      2.3.12.2 NAGase催化反应最适pH的测定  37
      2.3.12.3 NAGase催化反应最适温度的测定  37-38
      2.3.12.4 NAGase催化反应pH稳定性的测定  38
      2.3.12.5 NAGase催化反应温度稳定性的测定  38-39
第三章实验结果  39-76
  3.1 内表皮NAGase的分离纯化  39-41
  3.2 内表皮NAGase的纯度鉴定  41-42
  3.3 内表皮NAGase分子量的测定  42-43
  3.4 内表皮NAGase的化学修饰  43-47
    3.4.1 DTT对酶的化学修饰  43
    3.4.2 BrAc对酶的化学修饰  43-44
    3.4.3 NBS对酶的化学修饰  44
    3.4.4 EDC对酶的化学修饰  44-45
    3.4.5 醋酸酐对酶的化学修饰  45-46
    3.4.6 乙酰丙酮对酶的化学修饰  46-47
  3.5 水体污染物对内表皮NAGase活力的影响  47-53
    3.5.1 金属离子对NAGase活力的影响  47-48
      3.5.1.1 几种阴离子对内表皮NAGase活力的影响  47-48
      3.5.1.2 几种金属离子对内表皮NAGase活力的影响  48
    3.5.2 有机溶剂对内表皮NAGase活力的影响  48-53
      3.5.2.1 醇类物质对内表皮NAGase活力的影响  48-50
      3.5.2.2 丙酮对内表皮NAGase活力的影响  50
      3.5.2.3 甲醛对内表皮NAGase活力的影响  50
      3.5.2.4 二甲亚砜对内表皮NAGase活力的影响  50-51
      3.5.2.5 二氧六环对内表皮NAGase活力的影响  51-52
      3.5.2.6 二甲基甲酰胺对内表皮NAGase活力的影响  52-53
  3.6 饲料成分对内表皮NAGase活力的影响  53-57
    3.6.1 氨基酸对内表皮NAGase活力的影响  53-55
    3.6.2 糖类对内表皮NAGase活力的影响  55-57
  3.7 抗菌类药物对内表皮NAGase活力的影响  57-58
  3.8 不同生长期内表皮NAGase活力与性质的比较  58-62
    3.8.1 不同生长期内表皮NAGase活力的比较  58-59
    3.8.2 不同生长期内表皮NAGase催化pNP-NAG水解的动力学参数的比较  59
    3.8.3 不同生长期内表皮NAGase最适pH和pH稳定性的比较  59-61
    3.8.4 不同生长期内表皮NAGase最适温度和温度稳定性的比较  61-62
    3.8.5 不同生长期内表皮chitinase活力的比较  62
  3.9 不同生长期肝胰脏NAGase活力与性质的比较  62-68
    3.9.1 不同生长期肝胰脏NAGase活力的比较  62-63
    3.9.2 不同生长期肝胰脏NAGase催化pNP-NAG水解的动力学参数的比较  63-64
    3.9.3 不同生长期肝胰脏NAGase最适pH和pH稳定性的比较  64-66
    3.9.4 不同生长期肝胰脏NAGase最适温度和温度稳定性的比较  66-67
    3.9.5 不同生长期肝胰脏chitinase活力的比较  67-68
  3.10 不同季节内表皮NAGase活力与性质的比较  68-72
    3.10.1 不同季节内表皮NAGase活力的比较  68
    3.10.2 不同季节内表皮NAGase最适pH和pH稳定性的比较  68-70
    3.10.3 不同季节内表皮NAGase最适温度和温度稳定性的比较  70-71
    3.10.4 不同季节内表皮chitinase活力的比较  71-72
  3.11 不同季节肝胰脏NAGase活力和性质的比较  72-76
    3.11.1 不同季节肝胰脏NAGase活力的比较  72
    3.11.2 不同季节肝胰脏NAGase最适pH和pH稳定性的比  72-74
    3.11.3 不同季节肝胰脏NAGase最适温度和温度稳定性的比较  74-75
    3.11.4 不同季节肝胰脏chitinase活力的比较  75-76
第四章讨论  76-82
  4.1 内表皮NAGase的分离纯化与部分性质的研究  76
  4.2 内表皮NAGase的化学修饰  76-77
  4.3 效应物对内表皮NAGase活力的影响  77-79
    4.3.1 水体污染物对内表皮NAGase活力的影响  77-78
    4.3.2 饲料成分对内表皮NAGase活力的影响  78-79
    4.3.3 抗菌类药物对内表皮NAGase活力的影响  79
  4.4 不同生长期锯缘青蟹NAGase活力与性质的比较  79-80
  4.5 不同季节锯缘青蟹NAGase活力与性质的比较  80-82
第五章结论  82-84
参考文献  84-93
硕士研究生期间发表的学术论文  93-94
致谢  94

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