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miR-200c、miR-373~*在乳腺癌干细胞中的表达及其靶基因分析

作　者: 邱钧
导　师: 陈正堂
学　校: 第三军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: miRNA 实时定量PCR 双荧光素酶报告系统乳腺癌癌干细胞非编码RNA
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景和目的:微小RNA(microRNA,miRNA)属于非编码功能的小RNA,长约21-25nt,广泛存在于真核细胞中。miRNA最初转录本(pri-miRNA)经过RNaseⅢDrosha切割成长约60-70nt的前体miRNA(pre-miRNA),在核转运蛋白exportin-5的作用下由胞核转至胞质中,随后在另一种RNaseⅢDicer进一步切割成22nt左右的成熟的miRNA。成熟的miRNA与其他蛋白质形成RISC复合体(RNA-induced silencing complex),与靶mRNA的3′-UTR区完全或不完全配对,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。大量研究表明,miRNA在许多生物的生理和病理过程中发挥重要的作用,参与包括细胞增殖、分化、凋亡以及发育、代谢,并与疾病发生相关。近年来,越来越多证据表明,miRNA的异常表达与许多肿瘤的发生、发展密切相关,如乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌和慢性粒细胞白血病等。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率占全身各种恶性肿瘤的7%~ 10%,在妇女仅次于子宫癌。乳腺癌细胞易发生化疗耐药以及复发、转移,目前认为其根本原因在于治疗后乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)的残留。肿瘤干细胞是指生长不受控制,在肿瘤组织内数量较少的一群细胞群体,具有自我更新并多向分化的能力,是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断增大的根源。现已明确,乳腺癌干细胞表面分子表型为[ESA~+CD44~+CD24-/low],具有干细胞自我更新以及多向分化潜能的基本特性。miRNAs通过复杂的网络,对干细胞的自我更新、功能维持和哺乳动物的早期发育起着重要的调控作用。miRNAs同样也对乳腺癌干细胞起重要的调控作用,在乳腺癌的发生、发展、转移,预后中发挥着重要的作用。我们前期通过基因芯片筛选到乳腺癌干细胞相关的miRNA谱及乳腺癌相关的miRNA谱,因此,本研究旨在通过对乳腺癌干细胞相关miRNAs的研究,初步探讨关键miRNA参与乳腺癌发生、发展及转移的可能机制。方法:1、根据我们前期利用基因芯片筛选到的miRNA谱,以乳腺癌干细胞为实验组,以MCF-7乳腺癌细胞株为对照组,分析两者之间miRNA谱的差异,选择有差异表达的miR-200c、miR-373*为研究对象,进行了实时定量PCR检测miR-200c、miR-373*在乳腺癌干细胞和MCF-7细胞中的差异表达,并验证芯片结果。2、为进一步明确miR-200c、miR-373*具体作用靶点,我们通过Pitar、miRanda和Targetscan进行生物信息学分析,选择至少两种计算方法均能预测到的靶基因作为miR-200c、miR-373*可能的潜在靶基因。最后我们选取PDCD10、TCF2作为miR-200c的靶基因,EIF4A1、EEF1A1作为miR-373*的靶基因,并进行验证。3、为了验证这些预测的靶基因是否为miRNA真正作用的靶点,我们将预测的靶基因3′-UTR区序列中miRNA结合位点上下游的部分片段导入pGL3-Promoter荧光素酶表达载体中,以pRL-TK作为对照载体,构建双荧光素酶载体报告系统。实验分四组:①实验组:重组质粒pGL3-Promoter/5’→3’目的基因、对照质粒pRL-TK和相应pre-miRNAs共转染HeLa细胞。②对照组1:重组质粒pGL3-Promoter/3’→5’目的基因、对照质粒pRL-TK和相应的pre-miRNAs共转染HeLa细胞。③对照组2:重组质粒pGL3-Promoter/5’→3’(缺失种子序列)、对照质粒pRL-TK和相应的pre-miRNAs共转染HeLa细胞。④对照组3:重组质粒pGL3-Promoter/5’→3’目的基因和对照质粒pRL-TK共转染HeLa细胞。24小时后检测各组荧光素酶活性。结果:1、实时定量PCR结果显示:miR-373*在BCSCs细胞中较MCF-7细胞高表达7倍左右(6.684±0.548);miR-200c在BCSCs细胞中较MCF-7细胞低表达3倍左右(0.345±0.031)。2、生物信息学预测结果表明,miR-200c、miR-373*作用靶点是与细胞增殖、凋亡、细胞周期调控、细胞信号转导、癌基因、抑癌基因等生物特性密切相关的基因,涉及到肿瘤发生、发展和转移的各个方面,由此说明某些关键miRNA表达水平的失衡可能是乳腺癌发生和发展的重要原因之一。miR-373*与TP53INP2、CASP8、EIF4A1、EEF1A1等基因均具有可能靶位点。miR-200c与TCF2、TDE2、SYVN1、PDCD10、RAP2C等RAS癌基因家族等基因均具有可能靶位点。3、重组质粒pGL3-promoter/5’→3’目的基因、重组质粒pGL3-promoter/3’→5’目的基因、重组质粒pGL3-promoter/5’→3’(缺失种子序列)经XbaⅠ单酶切鉴定,用电泳观察酶切的结果,能获得约5000bp和100bp的酶切片段,与理论值一致,并经大连Takara公司测序后,碱基系列完全一致。同时表明重组载体构建成功。4、转染Hela细胞24h后,各组荧光素酶结果如下:(1) miR-200c:①作用靶点PDCD10:三个对照组Firefly/Renilla比值分别为13.992±2.5078、13.37±1.7313、12.36±1.441,实验组为6.4076±0.7378,较三个对照组相对荧光素酶活性明显下降,具有统计学意义(P<0.05)。②作用靶点TCF2:三个对照组Firefly/Renilla比值分别为13.3785±0.9969、13.6563±1.1815、11.9917±1.5689,实验组为10.6999±0.8447,实验组较三个对照组无统计学意义。(2) miR-373*:①作用靶点EIF4A1:三个对照组Firefly/Renilla比值分别为9.8096±0.4785、9.7426±1.0213、9.9832±0.7741,实验组为5.644±0.5281,较三个对照组相对荧光素酶活性明显下降,具有统计学意义(P<0.05)。②作用靶点EEF1A1:三个对照组Firefly/Renilla比值分别为10.3439±1.0819、9.5153±1.7906、9.4746±0.5593,实验组为9.3557±0.9452,实验组较三个对照组无统计学意义。结论:miR-200c在乳腺癌干细胞中较MCF-7细胞低表达,PDCD10是miR-200c的一个靶基因;miR-373*在乳腺癌干细胞中较MCF-7细胞高表达,EIF4A1是miR-373*的一个靶基因。

全文目录

英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
前言  13-17
  参考文献  15-17
第一部分实时定量PCR 检测miR-200c、miR-373*在乳腺癌干细胞中的表达.  17-24
  材料与方法  17-19
  结果  19-22
  讨论  22-23
  小结  23-24
第二部分 miR-200c、miR-373*靶基因的生物信息学分析  24-32
  方法  24
  结果  24-29
  讨论  29-31
  小结  31-32
第三部分 miR-200c、miR-373*相关靶基因的验证  32-59
  第一节携目的基因重组质粒的构建  32-48
    材料和方法  32-40
    结果  40-48
  第二节 miR-200c、miR-373*相关靶基因的双荧光素酶法验证  48-54
    材料与方法  48-52
    结果  52-54
  讨论  54-58
  小结  58-59
全文总结  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-65
文献综述 MicroRNA 在乳腺癌中的研究进展  65-73
  参考文献  70-73
硕士学位期间发表的论文  73

miR-200c、miR-373~*在乳腺癌干细胞中的表达及其靶基因分析

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