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外周血来源的CD14~+细胞穿透后在角膜内皮细胞诱导下的转化可能性研究

作　者: 丁姗姗
导　师: 吴静
学　校: 暨南大学
专　业: 眼科学
关键词: 脐静脉血管内皮 CD14~+细胞角膜内皮细胞穿透共培养
分类号: R772
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：探索体外外周血CD14+细胞穿透血管内皮细胞的模型,检测穿透后所得细胞的生物学性状。将穿透后所得细胞与角膜内皮细胞(Cornea endothelial cells, CECs)共培养,观察并探讨穿透后所得细胞的变化及其在角膜内皮细胞诱导下的转化可能性。方法：用酶消化法分离人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),通过传代培养,扩增。倒置光学显微镜观察细胞形态。MTT检测细胞增殖曲线,流式细胞仪检测细胞周期和免疫表型。用密度梯度分离法分离外周血中CD14+细胞,流式细胞术检测其含量。体外探索外周血CD14+细胞穿透血管内皮细胞的模型,倒置光学显微镜、原子力显微镜(Atomic force microscopy, AFM)观察穿透后所得细胞的形态。将穿透后所得细胞向成骨方向诱导分化,通过特异性染色鉴定其分化能力。穿透后所得细胞与角膜内皮细胞共培养,HE染色和原子力显微镜观察细胞变化,免疫荧光检测共培养后的细胞的免疫表达。结果：采用酶消化法分离培养的人脐静脉血管内皮细胞,P3、P5代细胞生长曲线基本一致,增殖能力较好,能满足实验需求。流式细胞仪分析第3代细胞强烈表达血管内皮特异性标志CD34,测得经密度梯度分离法从外周血中提取CD14细胞阳性率为73.2%。穿透模型获得的细胞呈现类似纤维细胞样外观,该细胞经成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节。穿透所得细胞与角膜内皮细胞共培养后,细胞形态由长梭形逐渐变为长三角形、类圆形,细胞间联系增加,胞质内空泡增加。免疫荧光法未见神经元特异性烯醇化酶表达。结论：本实验探索了体外培养扩增人脐静脉血管内皮细胞的方法,所培养的细胞成分单一,增殖良好,生物学性状稳定；实验中摸索了CD14+细胞穿透血管内皮细胞的模型,获得的细胞形态类似纤维细胞形态。该细胞可在体外被诱导分化为骨细胞。这种形态类似纤维细胞的细胞与角膜内皮细胞共培养后,在细胞形态上有所改变,经免疫荧光法检测这种形态类似纤维细胞的细胞发现没有表达角膜内皮细胞特异性的神经烯醇化酶,但其原子力显微镜下显示细胞形态有所改变,胞质内空泡增多,考虑其可能发生了细胞骨架方面的变化,这为我们后续的实验研究做了一些必要的前期实验铺垫。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-9
1 引言  9-15
  1.1 人角膜内皮细胞病理生理特点及治疗现状  9
  1.2 角膜内皮细胞组织工程研究现状  9-12
  1.3 循环成纤维细胞研究进展  12-14
  1.4 实验方法和意义  14-15
2 实验一人脐静脉内皮细胞的体外培养及鉴定  15-25
  2.1 前言  15
  2.2 材料与方法  15-20
  2.3 结果  20-21
  2.4 讨论  21-22
  2.5 结论  22-23
  2.6 附图附表  23-25
3 实验二 CD14~+细胞穿透血管内皮细胞模型的实验  25-34
  3.1 前言  25
  3.2 材料  25-27
  3.3 方法步骤  27-29
  3.4 结果  29-30
  3.5 讨论  30-31
  3.6 结论  31-32
  3.7 附图  32-34
4 实验三穿透后细胞向角膜内皮细胞转化可能性研究  34-45
  4.1 前言  34
  4.2 材料  34-35
  4.3 方法  35-37
  4.4 结果  37-38
  4.5 讨论  38-41
  4.6 结论  41-42
  4.7 附图  42-45
5 全文结论  45-46
6 不足与展望  46-47
7 参考文献  47-52
8 英文缩略词表  52-53
9 在学期间发表论文  53-54
10 致谢  54

外周血来源的CD14~+细胞穿透后在角膜内皮细胞诱导下的转化可能性研究

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