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左旋聚乳酸/壳聚糖/羟基磷灰石复合仿生支架修复大段骨缺损的实验研究

作　者: 郇松玮
导　师: 查振刚
学　校: 暨南大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞骨缺损壳聚糖左旋聚乳酸羟基磷灰石仿生支架骨组织工程
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：评价左旋聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石(poly(L-latic acid)/chitosan nano-fibers/nano-hydroxylapatite, PLLA/CSNF/nHA)复合仿生支架的生物相容性,探讨采用PLLA/CSNF/nHA复合支架的仿生结构,联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)修复新西兰兔桡骨大段缺损的可行性,并探索用骨组织工程修复大段骨缺损的新途径。方法：1、运用密度梯度离心法分离、传代培养新西兰兔BMSCS。2、BMSCs的鉴定：光镜及扫描电镜下行形态学观察；流式细胞法检测BMSCs表面标志物的表达。3、通过二次相分离技术制备左旋聚乳酸/壳聚糖纳米纤维(poly (L-latic acid)/chitosan nano-fibers, PLLA/CSNF)仿生支架,再经生物矿化后制得PLLA/CSNF/nHA复合仿生支架。测定支架孔隙率,并通过扫描电镜检测其仿生结构。4、将PLLA/CSNF/nHA仿生支架与BMSCs联合培养,通过检测细胞贴壁率、增殖率及细胞活性等方法,评价其细胞相容性。5、将PLLA/CSNF/nHA仿生支架植入新西兰兔皮下,于术后第4、8、12周取出材料,通过大体形态观察和苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察材料的组织相容性。6、制作新西兰兔桡骨1.5cm大段骨缺损模型,分三组进行实验,实验组缺损处植入PLLA/CSNF/nHA/BMSCs复合物、对照组植入PLLA/CSNF/nHA仿生支架、空白组不做处理,于术后第4、10、16周取材,通过大体形态观察、放射学检查和组织学检查等方法评价缺损修复情况。结果：1、通过密度梯度离心法可以有效获得BMSCs并在体外培养增殖。2、经流式细胞法检测,BMSCs的表面标志物CD29表达为92.01%,CD44表达为90.52%,CD34表达为0.36%,CD45表达为0.78%,BMSCs为长梭形,呈大小均一、排列紧密的漩涡状生长。3、PLLA/CSNF/nHA复合仿生支架大孔孔径为300～450μm,且大孔之间有内孔通联；支架中的壳聚糖纳米纤维分布均匀,其直径为200～500nm；支架孔隙率达90.27%,力学性能良好。4、扫描电镜下见BMSCs可在PLLA/CSNF/nHA支架材料上较好的生长,贴壁率12h达78.3%,共培养14d后细胞活力为96.27%,细胞周期中G0-G1期占92.33%。5、将PLLA/CSNF/nHA仿生支架植入新西兰兔皮下12周可自行降解,周围组织未见明显的水肿、坏死,HE染色未见明显炎症及排斥反应。6、术后末次观察,实验组已完成缺损修复,材料完全降解；对照组部分缺损修复,材料部分降解；空白组缺损主要由纤维结缔组织填充。结论：1、经密度梯度离心法获得的新西兰兔BMSCs可在体外长期、稳定培养,是理想的组织工程种子细胞。2、利用二次相分离技术制备的PLLA/CSNF/nHA复合支架具有类似细胞外基质的仿生结构,并具有良好的生物相容性和降解性能。3、利用PLLA/CSNF/nHA复合支架的仿生结构,并联合BMSCs在生物体内可以加快新骨生成,完成新西兰兔大段骨缺损的修复。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
1 绪论  10-17
  1.1 大块骨缺损的界定  10
  1.2 大段骨缺损临床修复的现状  10-11
  1.3 组织工程骨材料研究现状  11-15
  1.4 BMSCs的特异分化与成骨微环境  15
  1.5 本课题研究思路及目的  15-16
  1.6 本课题主要内容  16
  1.7 本课题创新及新颖之处  16-17
2 实验一 BMSCs的分离、纯化、培养及鉴定  17-26
  2.1 研究目的  17
  2.2 实验材料  17-19
  2.3 实验方法  19-20
  2.4 结果  20-21
  2.5 讨论  21-23
  2.6 结论  23-24
  2.7 附图  24-26
3 实验二 PLLA/CSNF/nHA仿生支架的制备及其生物性能的研究  26-40
  3.1 研究目的  26
  3.2 实验材料  26-27
  3.3 实验方法  27-30
  3.4 统计学分析  30
  3.5 结果  30-34
  3.6 讨论  34-36
  3.7 结论  36-37
  3.8 附图  37-40
4 实验三 PLLA/CSNF/nHA复合仿生支架联合BMSCs修复大段骨缺损的研究  40-50
  4.1 研究目的  40
  4.2 实验材料  40
  4.3 实验方法  40-41
  4.4 结果  41-43
  4.5 讨论  43-45
  4.6 结论  45-46
  4.7 附图  46-50
5 英文缩略词  50-51
6 参考文献  51-58
7 发表论文及参与科研活动  58-59
8 致谢  59

左旋聚乳酸/壳聚糖/羟基磷灰石复合仿生支架修复大段骨缺损的实验研究

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