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两种基于连接酶的检测KRAS和BRAF基因突变的方法的比较

作　者: 王惠惠
导　师: 陈超
学　校: 西北大学
专　业: 微生物学
关键词: KRAS BRAF 突变 LDR Gap-LCR 西妥昔单抗
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

KRAS基因外显子2上的七个热点突变与转移性结直肠癌患者服用西妥昔单抗等EGFR单抗类药物的疗效密切相关。根据大量的文献报道,携带KRAS突变型的结直肠癌患者对西妥昔单抗应答率很小,而携带KRAS野生型的结直肠癌患者对西妥昔单抗的应答率大大增加。KRAS基因的突变主要是点突变,位于外显子2密码子12、13上的七个突变发生频率可达90%以上。因此,通过检测大肠癌患者KRAS基因的七个热点突变,可以筛选出针对抗EGFR靶向治疗药物有效的患者人群,帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法,从而真正实现肿瘤病人的个体化治疗,还能大幅减少相关治疗费用和毒副作用。另外,进一步的研究指出,KRAS基因为野生型的结直肠癌患者,若携带BRAFV600E突变,也不能从西妥昔单抗治疗中获益。对KRAS野生型的结直肠癌患者再进行BRAF基因V600E的检测,能够进一步筛选出一部分不适合西妥昔单抗等EGFR单抗类药物治疗的KRAS野生型患者。因此,再结直肠癌患者中先进行KRAS七个突变的检测,再进行BRAF V600E的检测,能够更准确筛选出适合西妥昔单抗治疗的结直肠癌患者。为了实现临床对KRAS和BRAF基因突变的检测,建立一种快速、灵敏、重复性好的突变检测方法至关重要。目前已经有很多基于LDR结合测序或者是DNA芯片的突变检测方法,但这些方法都需要昂贵的仪器设备、试剂或是繁琐的实验操作。本研究建立并比较了两种较简便的检测KRAS七个热点突变和BRAF V600E突变的方法,即：缺口-连接酶链式反应(Gap-LCR)法和连接酶检测反应(LDR)法。因为缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)法操作繁琐且通量小,所以最终选取了连接酶检测反应(LDR)法检测KRAS七个突变和BRAF V600E。该法操作简便,检测灵敏度高(突变检出率可达5%),而且无需昂贵的实验设备,能够在普通的实验室或是条件有限的医院里开展。另外,为了提高检测通量,我们采用多重LDR结合Agilent 2100芯片生物分析仪检测法,实现了单孔检测8个突变的基因型,一张芯片检测12人份样本的通量。为了得到准确的检测结果,我们建立了KRAS七个突变和BRAF V600E的阳性质控体系。检测方法建立后,我们应用LDR法结合琼脂糖凝胶电泳对30例石蜡包埋的癌组织样本进行了KRAS七个突变和BRAF V600E的检测,并对其中4例组织样本的测序结果、LDR法结合琼脂糖凝胶电泳结果、LDR结合Agilent 2100芯片生物分析仪检测结果、MassArray法检测结果进行比对。LDR结合琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度高于测序,与MassArray法检测结果相比一致性可达50%,但是还有一部分MassArray法测试为杂合子的没有被检测出来,主要是由于LDR结合凝胶电泳检测结果灵敏度比不上MassArray法。但就其操作的简便性、使用仪器的便捷性、周期短等优点是MassArray法所无法比拟的。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
前言  9-11
第一章绪论  11-19
  1.1 药物基因组学概述  11
  1.2 几种常用的检测KRAS 突变方法的比较  11-14
  1.3 KRAS、BRAF基因突变的检测与个体化用药  14-17
    1.3.1 EGFR单抗类药物及其在结直肠癌治疗中的应用  15
    1.3.2 KRAS基因突变与EGFR单抗类药物疗效的关系  15-16
    1.3.3 BRAF基因突变与EGFR单抗类药物疗效的关系  16
    1.3.4 与EGFR单抗类药物疗效相关的其他基因  16-17
  1.4 立题背景与意义  17-19
第二章 KRAS七个热点突变、BRAF V600E阳性质控的建立  19-29
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 主要试剂  19
    2.1.2 培养基  19-20
    2.1.3 主要仪器  20
  2.2 方法  20-24
    2.2.1 PCR引物  20-21
    2.2.2 定点突变法克隆实验  21-24
  2.3 结果  24-27
    2.3.1 LDR结合琼脂糖凝胶电泳验证克隆结果  24-26
    2.3.2 测序验证克隆结果  26-27
  2.4 小结  27-29
第三章基于缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)检测突变方法的建立与优化  29-40
  3.1 材料与仪器  29
    3.1.1 材料  29
    3.1.2 试剂  29
    3.1.3 仪器  29
  3.2 实验方法  29-34
    3.2.1 突变检测方法的总体设计  29-30
    3.2.2 检测探针的设计、合成及溶解  30-32
    3.2.3 Gap-LCR检测突变方法的建立  32-33
    3.2.4 扩增产物的检测  33-34
  3.3 结果与讨论  34-39
  3.4 小结  39-40
第四章基于LDR检测突变方法的建立与优化  40-62
  4.1 材料与仪器  40
    4.1.1 材料  40
    4.1.2 试剂  40
    4.1.3 仪器  40
  4.2 实验方法  40-47
    4.2.1 突变检测方法的总体设计  40-41
    4.2.2 检测探针的设计、合成及溶解  41-43
    4.2.3 LDR检测突变方法的建立  43
    4.2.4 扩增产物的检测  43-46
    4.2.5 多重LDR检测突变方法的建立优化  46-47
  4.3 结果与讨论  47-60
    4.3.1 检测条件的优化和检测灵敏度的确定  47-51
    4.3.2 野生型基因组DNA的检测  51-53
    4.3.3 临床样本的检测  53-58
    4.3.4 多重LDR结合琼脂糖凝胶电泳和2100芯片生物分析仪检测结的比较  58-60
  4.4 小结  60-62
第五章 LDR、Gap-LCR检测突变方法的比较  62-64
全文小结  64-65
参考文献  65-71
附录  71-72
致谢  72

两种基于连接酶的检测KRAS和BRAF基因突变的方法的比较

内容摘要

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