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基于毛细管开管柱的酶反应器酶解技术的研究及在蛋白质组学中的应用

作　者: 胡佳薇
导　师: 申烨华；张养军
学　校: 西北大学
专　业: 化学
关键词: 开管毛细管柱蛋白质组学蛋白质酶切基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱
分类号: O657.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在蛋白质组学的研究中,由于样本量较为稀少,分离系统通常都为毛细管液相色谱系统,因此毛细管色谱柱在蛋白质组学的研究中至关重要。开管毛细管是通过在毛细管内壁涂布或键合有机改性剂而制备获得的,它的优点是制备过程简单、柱压低。本文是基于开管毛细管柱的蛋白质组学新技术新方法研究,以毛细管为载体,研究了一系列在毛细管内壁键合功能端基并应用在蛋白质组学研究中。为了实现蛋白质组鉴定时的在线酶切,本研究提出了新的固定化酶反应器新方法,即将酶固定在毛细管内壁上,制备了固定化酶反应器,极大的提高了蛋白质酶切的效率,大大缩短了传统的溶液酶切的时间,该方法能够使蛋白酶切时间由16小时缩短至1分钟,而且达到与传统的溶液酶切方法相同甚至更高的酶切效率。本论文主要围绕以毛细管为载体制备固定化酶反应器这一技术为中心,共分四章,主要内容如下：第一章介绍了蛋白质组学的背景意义及研究方法,并对生物质谱和蛋白质鉴定方法进行了详细的论述,之后对蛋白质酶切这一领域的重要性和最新技术进展展开了详细的叙述。进而提出,固定酶技术代替游离酶进行酶切已经成为了快速酶切的趋势,而以毛细管材料为载体的开管柱酶反应器更以其易于在线操作等优势获得了越来越多的人的关注。第二章研究了多层开管毛细管酶反应器的制备方法以及在蛋白质酶切中的应用。该方法将固定化酶反应器的制备方法应用于多层开管毛细管柱上,以戊二醛为双功能试剂,成功的制备了多层开管毛细管酶反应器,并将酶切后的蛋白用MALDI-TOF MS进行鉴定。结果显示,标准蛋白在经过酶反应器短时间酶切后获得了良好的酶切效果。第三章在第二章的基础上,主要研究了基于原子转移自由基聚合反应的酶反应器的制备方法及其在蛋白质酶切中的应用。首先制备了原子转移自由基聚合反应所需要的引发剂,并进一步利用甲基丙烯酸缩水甘油酯的聚合反应将环氧基键合到毛细管内壁上,之后分别引入氨基,利用戊二醛作为双功能试剂成功的将胰蛋白酶最终固定在毛细管内壁上。并将酶切后的蛋白进行了MALDI-TOF MS和FT LTQ-MS/MS鉴定,均得到了非常好的酶切效果。为了考察该方法制备的酶反应器的适用性,同样的酶切条件下我们将考察范围扩大至复杂样本-Hep G2细胞提取物的酶切效果,质谱鉴定结果显示这一方法对实际样本表现出了极好的可行性。第四章研究了以毛细管为载体的反相毛细管开管柱的制备方法及在多肽分离中的应用。首先对毛细管进行预处理后,在通过甲基丙烯酸月桂酯的聚合反应将C12基团键合到毛细管内壁上,制备成功后,将该反相开管柱应用于肌红蛋白酶切液的分离中,得到了较好的分离结果,为今后在液相色谱-质谱联用中分离分析多肽混合物进行了条件探索。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章绪论  10-26
  1.1 蛋白质组学研究的背景及意义  10-11
  1.2 蛋白质组学的技术路线  11-12
  1.3 生物质谱技术  12-16
    1.3.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱  13-14
    1.3.2 电喷雾电离质谱  14-15
    1.3.3 质谱鉴定技术  15-16
  1.4 蛋白质酶切  16
  1.5 固定化酶技术  16-19
    1.5.1 固定化酶技术的分类  17-18
    1.5.2 固定化酶反应器的应用  18-19
    1.5.3 以毛细管为载体固定酶的技术  19
  1.6 论文选题意义  19-21
  参考文献  21-26
第二章多层开管毛细管酶反应器的制备及在蛋白质酶切中的应用  26-45
  2.1 前言  26-27
  2.2 实验部分  27-29
    2.2.1 仪器与试剂  27
    2.2.2 多层开管毛细管酶反应器的制备  27-28
    2.2.3 标准蛋白的酶切  28
    2.2.4 标准蛋白酶切产物的质谱分析  28-29
  2.3 结果与讨论  29-41
    2.3.1 多层毛细管酶反应器的制备流程图  29-30
    2.3.2 胰蛋白酶固定前后的蛋白质的质谱图  30
    2.3.3 多层毛细管酶反应器的制备优化  30-32
    2.3.4 多层毛细管酶反应器的酶切条件优化  32-35
    2.3.5 多层开管毛细管柱酶反应器的整体性能考察  35-40
    2.3.6 多层开管毛细管柱酶反应器酶切复杂样品  40-41
  2.4 本章小结  41-43
  参考文献  43-45
第三章原子转移自由基聚合法用于制备开管柱酶反应器及在蛋白质酶切中的应用  45-65
  3.1 前言  45
  3.2 实验部分  45-50
    3.2.1 仪器与试剂  45-46
    3.2.2 原子转移自由基聚合反应引发剂的合成  46
    3.2.3 原子转移自由基聚合法用于酶反应器的制备  46-47
    3.2.4 标准蛋白的酶切  47
    3.2.5 酶反应器酶切Hep G2全蛋白  47-49
    3.2.6 质谱分析  49
    3.2.7 数据库检索  49-50
  3.3 结果与讨论  50-61
    3.3.1 原子转移自由基聚合反应的合成及条件优化  50-51
    3.3.2 酶反应器的制备流程  51
    3.3.3 酶反应器的制备条件优化  51-53
    3.3.4 酶反应器酶切蛋白质的条件优化  53-56
    3.3.5 酶反应器的酶切性能考察  56-61
  3.4 本章小结  61-63
  参考文献  63-65
第四章聚甲基丙烯酸月桂酯反相毛细管开管柱的制备及对肌红蛋白酶切产物的分离  65-73
  4.1 前言  65
  4.2 实验部分  65-67
    4.2.1 仪器与试剂  65-66
    4.2.2 开管毛细管反相色谱柱的制备  66
    4.2.3 标准蛋白酶切液的制备  66
    4.2.4 色谱及质谱条件  66-67
  4.3 结果与讨论  67-70
    4.3.1 开管毛细管反相色谱住的制备流程图  67-68
    4.3.2 开管毛细管柱的制备优化  68-69
    4.3.3 开管毛细管反相色谱柱分离肌红蛋白酶切液  69-70
  4.4 本章小结  70-71
  参考文献  71-73
结论  73-74
攻读硕士学位期间取得的科研成果  74-75
致谢  75

基于毛细管开管柱的酶反应器酶解技术的研究及在蛋白质组学中的应用

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