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产热凝胶粪产碱杆菌的生理代谢研究

作　者: 刘佳
导　师: 詹晓北
学　校: 江南大学
专　业: 生物化工
关键词: 热凝胶粪产碱杆菌 ntrC突变株蛋白质组学 Mn2+ UDP-Glucose
分类号: TS202.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

热凝胶是由粪产碱杆菌或土壤杆菌发酵产生的一种新型微生物胞外多糖,其安全无毒并且具有独特的理化性质,可广泛应用于食品、医药和化工等领域。热凝胶的发酵过程属于典型的生长非偶联型,发酵液中氮源耗尽后才开始合成多糖。由于氮源的缺乏,使得热凝胶合成期间细胞内相关酶的合成及其活性的恢复受到极大的限制,造成热凝胶合成速率的降低和发酵过程控制的困难。本文以高产热凝胶粪产碱杆菌WX-C12为研究对象,运用蛋白质组学技术,对热凝胶发酵过程中,氮源耗尽前后菌体总蛋白的表达变化进行了分析和鉴定；并且比较了粪产碱杆菌及其ntrC突变株生理代谢水平的差异,ntrC基因是氮源代谢调控组分NtrC蛋白的编码基因,从而对NtrC蛋白在调控热凝胶合成中的作用有了初步认识；另外本文还研究了Mn2+对热凝胶合成的影响情况,以了解Mn2+在菌体生理代谢中的作用。本文首先确立了蛋白分辨率高且重复性较好的粪产碱杆菌菌体总蛋白双向电泳图谱的构建方法：使用蛋白质裂解液提取菌体总蛋白,然后选择pH 4-7的IPG预制干胶条和适宜的等电聚焦程序进行第一向等电聚焦电泳,最后比较了考马斯亮蓝和硝酸银两种染色方法对双向电泳图谱的影响。随后利用上述构建的方法分别对热凝胶发酵过程中氮源耗尽前后的菌体总蛋白进行双向电泳分析,用PDQuest 8.0.1软件分析得电泳图谱中共有20个蛋白表达水平发生显著变化。选取其中5个蛋白进行质谱鉴定,成功鉴定出3个已知功能的蛋白,其中烯酰ACP还原酶与菌体生长受阻有关。另外,本文还对粪产碱杆菌和其ntrC突变株的菌体形态和热凝胶生产特性进行了比较。与原始菌株相比,ntrC突变株培养18 h后菌体形态有很大不同；并且其菌体生长和热凝胶合成的能力显著降低,证明了ntrC基因在热凝胶合成中具有重要的调控作用。同时采用双向电泳技术对ntrC突变株和原始菌株的菌体总蛋白进行分析发现有约40个蛋白没有在ntrC突变株中表达,有43个蛋白表达水平发生显著变化。通过飞行质谱成功鉴定得4个表达水平显著变化的蛋白,其中的N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶和核苷二磷酸激酶与氮源代谢和热凝胶合成有关。Mn2+对热凝胶合成影响的研究结果表明,摇瓶发酵18 h时提高培养基中MnCl2浓度至0.13g/L,热凝胶产量提高到22.3 g/L,与对照组相比提高了45.3%。并且通过测定菌体胞内UDP-Glucose的含量发现,提高Mn2+浓度后胞内UDP-Glucose含量总体降低,由此推测Mn2+对热凝胶合成的关键酶糖基转移酶的活性有一定促进作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章绪论  7-15
  1.1 热凝胶及其生产概况  7-10
    1.1.1 热凝胶简介  7-8
      1.1.1.1 热凝胶的结构  7
      1.1.1.2 热凝胶的特性  7-8
      1.1.1.3 热凝胶的应用  8
    1.1.2 热凝胶的生产  8-10
      1.1.2.1 热凝胶的生物合成途径  8-9
      1.1.2.2 热凝胶的生产菌株及发酵概况  9
      1.1.2.3 强化热凝胶合成策略的研究进展  9-10
  1.2 氮源调控系统简介  10-12
    1.2.1 氮源的吸收途径  11
    1.2.2 氮源代谢双组分调控系统NtrBC  11-12
  1.3 立题意义  12-13
  1.4 本论文的主要研究内容  13-15
第二章材料与方法  15-21
  2.1 实验材料  15-16
    2.1.1 菌种  15
    2.1.2 培养基  15
    2.1.3 主要试剂  15
    2.1.4 主要仪器  15-16
  2.2 实验方法  16-21
    2.2.1 培养方法  16-17
    2.2.2 分析方法  17-18
      2.2.2.1 热凝胶产量测定  17
      2.2.2.2 菌体浓度测定  17
      2.2.2.3 发酵液中葡萄糖测定  17
      2.2.2.4 发酵液中氯化铵测定  17
      2.2.2.5 胞内UDP-Glucose含量测定  17-18
      2.2.2.6 透射式电子显微镜检测  18
    2.2.3 蛋白质组学实验方法  18-21
      2.2.3.1 总蛋白提取方法  18
      2.2.3.2 SDS-PAGE电泳方法  18
      2.2.3.3 双向电泳方法  18-19
      2.2.3.4 图像扫描与分析方法  19
      2.2.3.5 质谱鉴定方法  19-21
第三章结果与讨论  21-41
  3.1 氮源耗尽前后粪产碱杆菌的蛋白质组学研究  21-28
    3.1.1 粪产碱杆菌菌体总蛋白双向电泳图谱的构建  21-24
      3.1.1.1 菌体总蛋白提取液的选择  21-22
      3.1.1.2 IPG预制干胶条pH范围的选择  22-23
      3.1.1.3 IEF电泳聚焦时间的选择  23-24
      3.1.1.4 染色方法的选择  24
    3.1.2 热凝胶分批发酵过程分析  24-25
    3.1.3 氮源耗尽前后粪产碱杆菌的差异蛋白比较  25-26
    3.1.4 氮源耗尽前后粪产碱杆菌部分差异蛋白点的质谱鉴定  26-28
  3.2 粪产碱杆菌及其ntrC突变株的生理代谢比较  28-33
    3.2.1 粪产碱杆菌及其ntrC突变株种子培养18h的菌体形态比较  28-29
    3.2.2 粪产碱杆菌及其ntrC突变株的热凝胶生产特性比较  29-30
    3.2.3 粪产碱杆菌及其ntrC突变株的差异蛋白比较  30-31
    3.2.4 粪产碱杆菌及其ntrC突变株部分差异蛋白点的质谱分析  31-33
  3.3 MnCl_2浓度对热凝胶合成的影响  33-41
    3.3.1 发酵初始阶段单独添加MnCl_2对热凝胶合成的影响  34-35
    3.3.2 提高初始阶段培养基中MnCl_2浓度对热凝胶合成的影响  35-36
    3.3.3 不同时间提高培养基中MnCl_2浓度对热凝胶合成的影响  36-37
    3.3.4 提高培养基中MnCl_2浓度对胞内UDP-Glucose含量的影响  37-38
    3.3.5 7L发酵罐中提高培养基MnCl_2浓度对热凝胶合成的影响  38-41
第四章主要结论与展望  41-43
  4.1 主要结论  41-42
  4.2 展望  42-43
致谢  43-45
参考文献  45-49
附录A:标准曲线  49-51
附录B:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  51

产热凝胶粪产碱杆菌的生理代谢研究

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