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桑叶多酚类物质分离提取及活性的初步研究

作　者: 丁双华
导　师: 韩晓祥；励建荣；叶立斌
学　校: 浙江工商大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 桑叶多酚多酚提取率多酚含量抗氧化性抑菌活性
分类号: TQ914.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本课题优化了桑叶多酚的提取工艺。把桑叶多酚粗分为乙醇层(MP)、石油醚层(MPP)、乙酸乙酯层(MPE)、正丁醇层(MPB)和水层(MPW)。建立了一个反相高效液相(RP-HPLC)法测定桑叶多酚类物质含量的方法,并结合液质联用(LC-MS)法,初步测定了桑叶中主要多酚类物质的分子质量和可能的分子式。探讨了桑叶提取物的抗氧化活性和抑菌活性,并对抑菌机理进行了初步探索。通过单因素实验和响应面分析法,得到桑叶多酚的最佳提取工艺参数为提取时间2 h,提取温度60℃,乙醇浓度46%,固液比1：25,在此条件下进行3次平行实验,桑叶多酚平均提取率为2.44%。建立了一个反相高效液相(RP-HPLC)法测定桑叶不同提取层多酚含量的方法。结果表明MP中绿原酸含量最高,其次是芦丁、槲皮苷、槲皮素、没食子酸、桑色素。MPP中检测到有槲皮素,未检测到没食子酸、绿原酸、芦丁、槲皮苷、桑色素的存在。MPE中绿原酸含量最高,其次是芦丁、槲皮苷、没食子酸、槲皮素、桑色素。MPB中芦丁含量最高,其次是槲皮素、槲皮苷、没食子酸、桑色素,无绿原酸检测出。MPW中槲皮苷含量最高,其次是绿原酸、没食子酸、芦丁,无桑色素、槲皮素检测出。通过多酚含量的多少与种类比较,说明桑叶多酚类成分多集中于中等极性的乙酸乙酯层(MPE)和乙醇层(MP)。通过ESI-MS离子流图,根据离子峰的分子质量,猜测可能的分子式,对照多酚标准品和参考文献,得到桑叶乙酸乙酯层(MPE)中可能含有绿原酸、咖啡奎宁酸、芦丁、柚苷等多酚类物质。采用体外抗氧化实验法,结果表明MPP、MPE、MP这三相的还原能力相当,比MPB高的多。MPE清除DPPH自由基的能力明显高于其他层,其中MPE的IC50为3.47 mg/mL,而MPB几乎没有DPPH自由基清除能力。MP、MPE、MPP的ABTS自由基清除能力比MPB高的多,其中MP、MPE、MPP的IC50分别为1.14 mg/mL、1.34 mg/mL、1.34 mg/mL。MPP、MP清除超氧自由基的能力远远高于其它层。MP的清除羟基自由基的能力远高于其他层,其中MP的IC50为10.09mg/mL。综上所述,桑叶乙酸乙酯层(MPE)、乙醇层(MP)的抗氧化能力较强。这可能与这两层中多酚类物质的含量与种类有关。采用牛津杯法和二倍稀释法研究桑叶提取物的抑菌效果,结果表明MPP和MPW对实验菌株无抑菌圈产生,MPE对藤黄微球菌(Micro coccus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)有抑菌圈产生,最小抑菌浓度(MIC值)分别为25.0 mg/mL、12.5mg/mL、100.0 mg/mL、25.0 mg/mL; MP对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E. coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)都有抑菌圈产生,MIC值分别为12.5 mg/mL、12.5 mg/mL、25.0 mg/mL、50.0 mg/mL。在抑菌机理的初步研究中,发现MPE、MP对细菌细胞壁、细胞膜以及蛋白质的合成都有较大的影响,MPE的影响作用比MP的更大。在环境扫描和透射电镜图中,可以看到经MPE处理的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌体形状未有改变,但是菌体细胞膜、细胞壁有破裂,细胞完整性被破坏,细胞内容物泄出,导致细胞失去代谢和增殖活性。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第1章绪论  11-21
  1.1 桑叶的研究进展  11-15
    1.1.1 桑叶资源概况  11
    1.1.2 桑叶的化学成分  11-13
    1.1.3 桑叶的药理作用  13-15
    1.1.4 桑叶的开发利用  15
  1.2 植物多酚类物质的研究进展  15-19
    1.2.1 植物多酚的概念  15-16
    1.2.2 植物多酚的分类  16-17
    1.2.3 植物多酚的测定  17-18
    1.2.4 植物多酚的研究利用  18-19
  1.3 本课题的选题背景、研究意义及研究内容  19-21
    1.3.1 选题背景与研究意义  19-20
    1.3.2 研究内容与思路  20-21
第2章桑叶多酚类物质提取工艺的研究  21-31
  2.1 材料和仪器  21
    2.1.1 实验材料  21
    2.1.2 实验仪器  21
  2.2 实验方法  21-23
    2.2.1 原料处理  21
    2.2.2 多酚类物质的提取  21-22
    2.2.3 多酚含量的测定  22
    2.2.4 响应面优化提取桑叶多酚类物质的研究  22-23
  2.3 统计分析  23
  2.4 实验结果与讨论  23-30
    2.4.1 没食子酸标准曲线  23-24
    2.4.2 桑叶多酚类物质提取工艺的研究  24-30
  2.5 本章小结  30-31
第3章桑叶多酚类物质含量测定及LC-MS初步分析  31-47
  3.1 材料和仪器  31
    3.1.1 实验材料  31
    3.1.2 实验仪器  31
  3.2 实验方法  31-32
    3.2.1 样品前处理  31-32
    3.2.2 标准溶液的配制  32
    3.2.3 色谱条件的确定  32
    3.2.4 方法学验证  32
    3.2.5 ESI-MS条件  32
  3.3 统计分析  32-33
  3.4 实验结果与讨论  33-45
    3.4.1 色谱条件优化  33-35
    3.4.2 定性分析  35-36
    3.4.3 方法学验证结果  36-37
    3.4.4 桑叶提取物的分析  37-40
    3.4.5 ESI-MS图谱分析  40-45
  3.5 本章小结  45-47
第4章桑叶的抗氧化活性评估  47-56
  4.1 材料和仪器  47-48
    4.1.1 实验材料  47
    4.1.2 实验仪器  47-48
  4.2 实验方法  48-49
    4.2.1 样品处理  48
    4.2.2 还原力测定  48
    4.2.3 DPPH自由基清除能力的测定  48
    4.2.4 ABTS方法  48-49
    4.2.5 清除超氧阴离子自由基能力的测定  49
    4.2.6 清除羟基自由基能力的测定  49
  4.3 统计分析  49
  4.4 实验结果与讨论  49-54
    4.4.1 桑叶提取物的还原力  49-50
    4.4.2 桑叶提取物清除DPPH自由基的能力  50-52
    4.4.3 桑叶提取物清除ABTS自由基的能力  52
    4.4.4 桑叶提取物清除超氧阴离子自由基的能力  52-53
    4.4.5 桑叶提取物清除羟基自由基的能力  53-54
  4.5 本章小结  54-56
第5章桑叶的抑菌活性评估  56-70
  5.1 材料和仪器  56-57
    5.1.1 实验材料  56
    5.1.2 实验仪器  56-57
  5.2 实验方法  57-60
    5.2.1 样品处理  57
    5.2.2 菌株处理  57
    5.2.3 抑菌效果的测定(牛津杯法)  57-58
    5.2.4 抑菌活性的比较  58
    5.2.5 最低抑菌浓度的确定  58
    5.2.6 抑菌机理的初步研究  58-60
  5.3 统计分析  60
  5.4 实验结果与讨论  60-69
    5.4.1 桑叶提取物抑菌活性的比较  60-61
    5.4.2 桑叶提取物最低抑菌浓度(MIC)的比较  61-62
    5.4.3 桑叶提取物对细菌细胞壁通透性的影响  62-64
    5.4.4 桑叶提取物对细菌细胞膜通透性的影响  64-65
    5.4.5 桑叶提取物对细菌可溶性蛋白含量的影响  65-67
    5.4.6 电镜观察效果  67-69
  5.5 本章小结  69-70
第6章结论、创新点和存在问题  70-72
参考文献  72-78
附录一中英文名词术语对照表  78-79
附录二研究生期间发表的论文  79-80
致谢  80-81

桑叶多酚类物质分离提取及活性的初步研究

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