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γ-聚谷氨酸发酵优化以及药物增溶的研究

作　者: 王辉
导　师: 史延茂；董超
学　校: 河北工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 纳豆芽孢杆菌多聚谷氨酸黄连素增溶剂
分类号: TQ922.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

γ-聚谷氨酸是由微生物发酵而成的可生物降解的高分子多肽。一般由上千个谷氨酸单体组成,分子量20万-100万,不同的菌种能够产生不同分子量的γ-PGA。γ-PGA在自然界或人体内能降解成内源性物质-谷氨酸,而不产生蓄积和毒副作用。且谷氨酸单体的氨基和羧基和通过γ-酰胺键结合而成γ-PGA。但是一般发酵液中生成的γ-PGA浓度较低,会给产物的分离纯化带来困难,从而使生产成本较高,国内尚未真正实现工业化生产。黄连素与大多数药物一样存在溶解度低机体吸收困难,导致其生物利用度低(一般为10%,<25%)耐受性差,药效差,大大减少其应用。而用纳米乳给药系统增加药物的溶解度,制备出的黄连素纳米乳,能较大提高黄连素的生物利用度,提高其药效、减少剂量和降低其毒副作用。主要研究方向为(1)高效生产γ-PGA;(2)γ-PGA分离纯化;测定以及低分子量γ-PGA的制备(3)对传统的黄连素制剂进行增溶。采用Plackett-Burman法对发酵工艺进行评价,得出培养基配方对多聚谷氨酸的产量有显著影响的因子包括:葡萄糖、豆饼粉、谷氨酸钠,然后用响应面法对这几个因素进行优化,所得的最佳培养基配方为:葡萄糖8%,豆饼粉3.2%,谷氨酸钠4.8%, MgSO4 0.06% ,CaCl2 0.06% ,K2HPO4 0.39% ,KH2PO4 0.3%灭菌前前pH 7.5,γ-PGA产量由原来的15.4g/L提高到32g/L。γ-PGA的高粘度发酵液体积为上清液的4倍,沉淀得到γ-PGA。然后用去离子水溶解γ-PGA,透析除去小分子,真空冷冻干燥得到白色结晶。利用薄层层析,电泳法,GPC法测定,进行了测定,γ-PGA的纯度在75%左右,分子量在400KDa左右,通过酸降解法和控制发酵时间的方法分别对其分子量的降低起到了一定的作用,能够得到40-100KDa左右的片段。对发酵过程的研究确定了菌株在最适条件下发酵56h时,产量和分子量均能达到最大发现了转氨酶的活性显著下降消旋酶的活性则一定程度的提高γ-PGA的构型D/L的比例会随着发酵的进行逐渐的接近1:4。采用分光光度法测定盐酸黄连素的浓度,标准曲线为Y=70500X,线性拟合系数达到0.9996,实验结果显示增溶剂的干扰可以忽略不计;盐酸黄连素的溶解度随温度升高而增加,80℃时最高;溶液中性时最高,酸性和碱性时溶解度都有所下降;利用β-环糊精、羟丙基环糊精和γ-PGA作为盐酸黄连素的包合物,其溶解度最高可以达到水溶液中的1.80倍和2.15倍,而聚乙二醇4000的增溶效果不佳.

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-17
  §1-1 γ-聚谷氨酸的结构和性质  9-11
    1-1-1 γ-PGA 的结构  9-10
    1-1-2 γ-PGA 的性质  10-11
  §1-2 产生γ-PGA 的微生物  11-12
  §1-3 γ-PGA 的制备方法  12
    1-3-1 化学合成法  12
    1-3-2 生物提取法  12
    1-3-3 微生物发酵法  12
  §1-4 生物聚合生成γ-PGA 的机理  12-14
  §1-5 γ-PGA 的生产工艺  14
    1-5-1 发酵工艺  14
    1-5-2 提取工艺  14
  §1-6 γ-PGA 的应用  14-15
    1-6-1 γ-PGA 在医药领域的应用  14-15
  §1-7 黄连素药用作用及其研究进展  15-16
    1-7-1 黄连素的性质  15
    1-7-2 黄连素的药用作用及研究进展  15-16
    1-7-3 对于难溶性药物溶解度的提高方法  16
  §1-8 本论文的研究意义和目的  16-17
第二章 γ-PGA 的筛选影响发酵优化  17-26
  §2-1 引言  17
  §2-2 材料与方法  17-25
    2-2-1 主要实验材料与仪器  17-18
    2-2-2 菌体发酵培养  18-19
    2-2-3Plackett-Burman 筛选影响γ-PGA 产量的发酵因子  19-20
    2-2-4 Box-Behnken 设计  20
    2-2-5 发酵条件的优化研究  20-25
  §2-3 总结  25-26
第三章 γ-PGA 的纯化测定和低分子量的制备  26-38
  §3-1 引言  26
  §3-2 γ-PGA 的提取  26-28
    3-2-1 γ-PGA 的分离提取方法  26-27
    3-2-2 发酵液胞液分离条件的优化  27
    3-2-3 分离纯化的最终流程  27-28
  §3-3 γ-PGA 的测定  28-36
    3-3-1 薄膜层析对γ-PGA 的鉴定  28-29
    3-3-2 γ-PGA 含量的测定  29-33
    3-3-3 γ-PGA 分子量的测定  33-35
    3-3-4 L 型或D 型γ-PGA 比率的分析  35
    3-3-5 酶活性的测定  35
    3-3-6 菌浓测定  35-36
  §3-4 低分子量γ-PGA 的获得  36-38
    3-4-1 γ-PGA 的酸水解  36-37
    3-4-2 γ-PGA 分子量的发酵控制  37-38
  §3-5 总结  38
第四章黄连素溶解度及增溶材料筛选  38-44
  §4-1 引言  38-39
  §4-2 黄连素增溶实验设计  39-40
    4-2-1 主要实验仪器用品  39
    4-2-2 实验方法  39-40
  §4-3 实验结果与分析  40-44
    4-3-1 盐酸黄连素随温度的变化  40
    4-3-2 盐酸黄连素在不同酸碱环境下的变化  40-41
    4-3-3 盐酸黄连素和增溶剂的扫描图谱  41-42
    4-3-4 黄连素的浓度标准曲线  42
    4-3-5 溶液环境对回收率的影响  42-43
    4-3-6 相溶解度曲线  43-44
  §4-4 小结  44
第五章结论  44-45
参考文献  45-51
致谢  51
攻读硕士期间所取得的相关科研成果  51

γ-聚谷氨酸发酵优化以及药物增溶的研究

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