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深海来源生物活性真菌的筛选与初步鉴定及WP3次生代谢产物的研究

作　者: 易志伟
导　师: 王风平
学　校: 国家海洋局第三海洋研究所
专　业: 海洋生物学
关键词: Shewanella piezotolerans WP3 海洋真菌代谢产物细胞毒活性
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

深海环境占地球表面积的49%,被认为是目前地球上物种资源最丰富的地区。深海微生物处于高压、低温(部分区域如热液口为高温)、厌氧、极端pH、高盐浓度、高金属浓度、无光照、寡营养、高卤素等特殊极端环境中。由于其生态环境的特殊性,决定了深海微生物具有一些特异的代谢途径和遗传背景,导致深海微生物次生代谢产物具有化学结构奇特、新颖,生物活性多样等特点。特殊结构天然产物,对于增强药物的特异性和有效性、减少毒副作用和防止耐药性等均至关重要,对发现药物先导化合物、研究药物作用新靶点、新机理等具有重要科学意义。自20世纪60年代以来,海洋天然产物开发越来越受人关注,分离自海洋的化合物总数和新化合物数量都快速增长,2007年有报道的海洋的新天然产物数量为961个,较2006年数量增长24%。海洋微生物来源的天然产物开发成为热点,其化合物增长速度远高于海洋天然产物中比重最大的海绵动物来源化合物的增长速度。2007年来自海洋微生物的化合物数量较1965至2005年平均数量增长了5倍,比2006年增长了60%以上。本文利用中国大洋一号20航次采集的深海沉积物样品进行了真菌分离鉴定,获得110株深海来源真菌,这些菌分属于15个属。其中曲霉和青霉最多,共为55株,占50%,且重复较多,只分布于10个种。利用CCK8法及琼脂扩散法对其中的100株深海来源真菌进行了抗肿瘤及抗菌活性检测,发现深海来源真菌具有良好的生物活性,细胞毒阳性率占49%,26%的菌株具有明显抗大肠杆菌效果,23%明显抗枯草,5%抗白假丝酵母,21%抗金黄色葡萄球菌。生物活性与培养基成分及筛选用肿瘤细胞株类型相关。对具有生物活性的20株深海来源真菌发酵粗提物进行了HPLC指纹图谱初步分析,发现其HPLC指纹图谱与培养基成分相关。该研究为后期分离鉴定深海来源真菌产生的生物活性化合物奠定了良好基础。细菌Shewanella piezotolerans wp3为一株分离自西太平洋1914米深海沉积物中的一株革兰氏阴性菌。通过检测WP3和分离自同一深海位点的两株深海耐嗜压菌Shewanella psychrophila WP2次生代谢产物的抗肿瘤活性,研究了温度、压力、嗜菌体对WP3次生代谢产物抗肿瘤活性的影响。发现WP3次生代谢产物具有良好抗肿瘤活性,低温因素可提高其抗肿瘤活性,在最适温度情况下,压力因素可降低其抗肿瘤活性,而在低温情况下,压力因素对其抗肿瘤活性无影响,嗜菌体对抗肿瘤活性影响不大。HPLC指纹图谱分析发现不同温度条件下,其次生代谢产物指纹图谱有变化。结合细胞毒活性分析结果,通过色谱分离、质谱、核磁共振技术,对WP3发酵浸膏进行了化合物的分离鉴定,目前已经解析了两个单体化合物,但该两个化合物不具有细胞毒活性,后期还需进一步分离鉴定发酵浸膏中具有抗肿瘤活性的次生代谢产物,探讨细胞毒活性化合物与WP3深海环境适应性之间的可能关系。

全文目录

中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
前言  13-38
  1.1 海洋天然产物研究概况  14-17
  1.2 海洋抗肿瘤药物的发展  17-22
    1.2.1 海洋抗肿瘤药物的种类  17-22
  1.3 海洋真菌抗肿瘤活性物质研究概况  22-33
  1.4 海洋细菌活性化合物研究概况  33-37
  1.5 本课题研究目的、内容和意义  37-38
第一章深海沉积物真菌初步鉴定与活性菌株筛选  38-58
  1 材料与方法  39-46
    1.1 材料  39-42
      1.1.1 样品来源  39-40
      1.1.2 肿瘤细胞株  40
      1.1.3 菌株  40
      1.1.4 常用培养基  40-41
      1.1.5 主要试剂及耗材  41-42
      1.1.6 主要仪器  42
    1.2 方法  42-46
      1.2.1 菌株的分离  42-43
      1.2.2 菌株鉴定  43-44
        1.2.2.1 真菌DNA的提取  43
        1.2.2.2 PCR扩增  43-44
        1.2.2.3 真菌总DNA的纯化  44
      1.2.3 菌株的培养及测定样品的制备  44
      1.2.4 肿瘤细胞的培养  44-45
      1.2.5 CCK-8法测定抗肿瘤活性  45
      1.2.6 抗菌活性测定  45
      1.2.7 HPLC指纹图谱分析  45-46
  2 结果与分析  46-57
    2.1 真菌分离鉴定结果  46-48
    2.2 抗肿瘤活性检测  48-52
    2.3 抗菌活性检测  52-55
    2.4 HPLC检测生物活性真菌发酵粗提物  55-57
  3 小结与展望  57-58
第二章 Shewanella piezotolerans wp3的抗肿瘤次生代谢产物研究  58-74
  1 材料与方法  60-65
    1.1 材料  60-61
      1.1.1 菌株  60
      1.1.2 常用化学试剂  60
      1.1.3 显色剂  60
      1.1.4 常用培养基  60-61
      1.1.5 主要试剂及耗材  61
      1.1.6 主要仪器  61
    1.2 方法  61-65
      1.2.1 菌株培养  61
      1.2.2 发酵浸膏的萃取  61-62
      1.2.3 技术路线  62
      1.2.4 天然产物的分离纯化  62-63
        1.2.4.1 薄层层析(TLC)  62
        1.2.4.2 硅胶制备板  62-63
        1.2.4.3 硅胶柱层析  63
      1.2.5 化合物的结构鉴定  63
      1.2.6 化合物的结晶  63-64
      1.2.7 质谱分析  64-65
  2 结果与分析  65-73
    2.1 CCK8法检测抗肿瘤活性  65-66
      2.1.1 Shewanella piezotolerans wp3和Shewanella psychrophila wp2次生代谢产物抗肿瘤活性比较  65-66
      2.1.2 温度对Shewanella piezotolerans wp3次生代谢产物抗肿瘤活性的影响  66
      2.1.3 压力对Shewanella piezotolerans wp3次生代谢产物抗肿瘤活性的影响  66
    2.2 Shewanella piezotolerans wp3次生代谢产物HPLC指纹图谱分析  66-68
    2.3 WP3次生代谢产物分离  68-72
      2.3.1 WP3菌株的发酵及代谢产物提取  68
      2.3.2 WP3菌株代谢产物分离  68-71
      2.3.3 化合物6-5-1结构解析  71-72
      2.3.4 化合物6-5-2结构解析  72
    2.4 化合物活性检测  72-73
  3 结论与讨论  73-74
参考文献  74-83
致谢  83-84
附录  84-89

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