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桃再生体系的优化与反义PG基因遗传转化的研究

作　者: 张亚林
导　师: 李唯
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 作物生态生理
关键词: 桃遗传转化再生体系根癌农杆菌反义PG基因转基因植株
分类号: S662.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 30次
引　用: 1次
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内容摘要

桃(Prunus persica(L. ) Batsch)是世界性重要果树,我国是桃主产国,产量居世界之首,甘肃省是桃的原产地和最适栽培区之一。桃是典型的呼吸跃变型果实,成熟果实采后很快出现呼吸高峰,果肉迅速变软,给贮藏运输带来极大不便,这是长期制约桃生产的主要问题之一。而通常采用的低温冷藏等方法易造成桃果冷害,结果十分不理想。因此,通过植物基因工程技术控制果实软化,选育出耐贮运的桃新品种是从根本上解决桃贮运难题的有效途径之一。本研究通过反义基因技术特异性抑制果实成熟后PG的表达,有望延迟桃果实的软化,获得耐贮性硬溶质桃新种质。本研究以甘肃省常栽品种白粉桃为试材,建立了桃遗传转化再生体系,并以白粉桃茎段为材料,在优化桃遗传转化再生体系的基础上,通过根癌农杆菌介导反义PG基因转化,得到了转化植株并用PCR进行了检测。研究主要取得如下结果:1.以白粉桃幼茎和花后不同时间成熟的果实种胚为外植体,进行桃遗传转化再生体系优化。其幼茎最佳诱导培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.5mg/L,诱导率可达93.5%。开花75d后的种胚能在MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L上直接诱导分化成苗,诱导分化率可达91.5%。将不定芽用100mg/L IBA浸蘸其基部转移到不含激素的1/2MS培养基中诱导生根,生根率达到78%。2.用携带有PG基因反义片段和35S启动子的表达载体pCAMBIA2300,转化白粉桃茎段。受体材料预培养3d后,经根癌农杆菌菌液(OD600值0.4)浸染10min后共培养60h,转移至分化培养基MS+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.5 mg/L+kan 50mg/L+Cef 250mg/L上诱导产生不定芽,将抗kan的不定芽先后置于含有kan 50mg/L的生长、增殖和生根培养基上继续选择,获得完整植株。经PCR检测初步证明,反义PG基因已导入桃中。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略词表  7-11
第一章文献综述  11-25
  1 引言  11-12
  2 桃果实软化变质的影响因素  12-15
    2.1 水解酶类  12-14
      2.1.1 多聚半乳糖醛酸酶(PG)  12-13
      2.1.2 果胶甲酯酶(PE)  13
      2.1.3 β-半乳糖苷酶(β-Gal)  13
      2.1.4 木葡聚糖内糖基转移酶(XET)  13
      2.1.5 纤维素酶(CX)  13-14
    2.2 植物激素  14
      2.2.1 乙烯  14
      2.2.2 脱落酸(ABA)  14
      2.2.3 生长素(IAA)  14
    2.3 贮藏条件  14-15
      2.3.1 温度  14-15
      2.3.2 气体成分  15
      2.3.3 相对湿度  15
  3 多聚半乳糖醛酸酶研究进展  15-17
    3.1 多聚半乳糖醛酸酶的种类和性质  15-16
    3.2 多聚半乳糖醛酸酶基因表达的分子调控  16-17
    3.3 多聚半乳糖醛酸酶与植物激素的关系  17
      3.3.1 乙烯对多聚半乳糖醛酸酶的影响  17
      3.3.2 其它几种植物激素  17
  4 反义RNA 技术在果实成熟中的应用  17-18
  5 桃组织培养研究进展  18-21
    5.1 外植体类型  18-20
      5.1.1 茎尖培养  18-19
      5.1.2 胚培养  19
      5.1.3 其它外植体的培养  19-20
    5.2 愈伤组织的诱导与不定芽的分化  20
    5.3 生根培养  20-21
  6 桃遗传转化的研究进展  21-23
    6.1 根癌农杆菌介导技术简介  21-22
      6.1.1 转化机理  21-22
      6.1.2 农杆菌转化的特点  22
    6.2 桃遗传转化  22-23
      6.2.1 农杆菌介导法转化桃  22-23
      6.2.2 基因枪轰击法转化桃  23
  7 本研究的目的及意义  23-24
  8 技术路线  24-25
第二章桃遗转化再生体系的优化  25-35
  1 实验材料  25-26
    1.1 材料  25
    1.2 试剂  25
    1.3 培养基  25
    1.4 激素配置  25
    1.5 实验仪器  25-26
  2 实验方法  26-29
    2.1 桃茎段的离体培养  26-27
      2.1.1 培养基  26
      2.1.2 方法  26-27
    2.2 种胚直接诱导不定芽再生  27-28
      2.2.1 培养基  27
      2.2.2 方法  27-28
    2.3 桃茎段试管苗不定根的诱导  28
      2.3.1 培养基  28
      2.3.2 方法  28
    2.4 实验资料统计  28-29
  3 结果与分析  29-34
    3.1 桃茎段离体培养体系的建立  29-30
      3.1.1 不同接种时间和消毒时间对芽萌发和生长的影响  29-30
      3.1.2 不同激素配比对丛生芽培养的影响  30
    3.2 桃种胚离体培养体系的建立  30-32
      3.2.1 不同采集时间对种胚萌发率的影响  30-31
      3.2.2 不同消毒时间对种胚萌发率的影响  31
      3.2.3 不同激素配比对种胚直接诱导分化的影响  31-32
    3.3 桃茎段试管苗不定根的诱导  32-34
      3.3.1 IBA 对诱导生根的影响  32-33
      3.3.2 NAA 对诱导生根的影响  33-34
  4 讨论  34-35
第三章根癌农杆菌介导桃转化反义PG 基因  35-50
  1 试验材料  35-36
    1.1 供试材料  35
    1.2 供试试剂  35
    1.3 试验仪器  35-36
    1.4 质粒及菌株  36
    1.5 培养基  36
      1.5.1 农杆菌培养基  36
      1.5.2 植物选择培养基  36
  2 试验方法  36-41
    2.1 农杆菌感受态细胞的制备  36-37
    2.2 pCAMBIA2300 质粒向农杆菌感受态细胞中的转化  37
    2.3 质粒的验证  37-38
      2.3.1 质粒的提取  37-38
      2.3.2 质粒PCR 检测  38
    2.4 选择压力的筛选  38-39
    2.5 根癌农杆菌介导PG 反义基因转化桃  39-41
      2.5.1 农杆菌的培养及活化  39
      2.5.2 预培养  39
      2.5.3 侵染  39
      2.5.4 共培养  39
      2.5.5 不定芽选择培养  39
      2.5.6 生根培养  39-40
      2.5.7 转化植株的检测  40-41
  3 结果与分析  41-45
    3.1 质粒验证  41-42
    3.2 白粉桃茎段kan 抗性的筛选  42
    3.3 抑菌素浓度对农杆菌生长的影响  42
    3.4 预培养时间对转化效率的影响  42-43
    3.5 菌液浓度及浸染时间对转化效率的影响  43-44
    3.6 共培养时间对转化效率的影响  44
    3.7 添加乙酰丁香酮对桃茎段丛生芽诱导率的影响  44-45
    3.8 转化植株的PCR 检测  45
  4 讨论  45-50
    4.1 卡那霉素浓度的筛选  45
    4.2 影响根癌农杆菌介导转化的因素  45-48
    4.3 乙酰丁香酮对转化效果的影响  48
    4.4 转化程序的优化  48-50
第四章结论  50-51
附图  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-59
导师简介  59-60
作者简介  60

桃再生体系的优化与反义PG基因遗传转化的研究

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