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类风湿关节炎患者炎性环境对间充质干细胞影响的体外实验研究

作　者: 蒋志琼
导　师: 唐中
学　校: 川北医学院
专　业: 内科学
关键词: 类风湿关节炎 间充质干细胞 炎性环境 实验研究
分类号: R593.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潜能、组织损伤修复及独特的免疫调节作用,为类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)等自身免疫性疾病的治疗带来了新的应用前景。但是在以往有关MSCs治疗RA的实验研究中, MSCs能否发挥预期的治疗作用仍存在着争议。我们拟通过体外实验了解RA患者炎性体液对外源性MSCs的影响,初步探讨MSCs在RA炎性环境中其自身生物学特性的改变。方法:1.骨髓MSCs的分离、培养及鉴定:共收集健康志愿者骨髓标本14例,其中5例采用单纯贴壁筛选法,另9例采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法对细胞进行分离、培养、传代,成骨诱导检测其分化能力,并绘制P3代MSCs生长曲线。取P3代MSCs用于后续实验。2. RA患者血清对MSCs增殖的影响:共12例RA患者及4例健康体检者血清纳入研究。将MSCs以相同的数量(约4000个/孔)接种于96孔板。实验组MSCs培养液中分别加入10%、30%浓度的RA患者血清,对照组MSCs则加入对应浓度的健康体检者血清,每份标本每个浓度制备三个复孔。培养5天后采用MTT法检测各孔吸光度值(absorbance,A值)。3.经RA患者血清作用后的MSCs对T细胞增殖的影响:将MSCs以相同的数量(约4000个/孔)接种于96孔板。实验组MSCs培养液中加入30%RA患者血清,对照组MSCs培养液中则加入30%健康体检者血清。培养5天后,收集活动期RA患者外周血10ml,分离收获CD3+T淋巴细胞,与实验组及对照组MSCs共培养,并设置单独MSCs及T细胞培养组,用植物血凝素刺激T细胞增殖。68h后采用MTT法检测各孔A值。4. RA患者关节液对MSCs增殖的影响:将MSCs以相同的数量(约4000个/孔)接种于96孔板。实验组MSCs培养液中分别加入10%、30%、50%浓度的RA患者关节液上清,以MSCs培养液中不加关节液为对照组。培养5天后采用MTT法检测各孔A值。5. RA患者关节液对MSCs凋亡的影响:将MSCs以相同的数量(约105个/孔)接种于6孔板,实验组MSCs培养液中加入50%浓度的RA患者关节液上清,以MSCs培养液中不加关节液为对照组。培养5天后消化收获各组细胞,采用凋亡试剂盒流式细胞仪检测各组MSCs的凋亡情况。6. RA患者关节液对MSCs成骨诱导的影响:将MSCs以相同的数量(约105个/孔)接种于6孔板。实验组MSCs培养液中加入50% RA患者关节液上清,以MSCs培养液中不加关节液为对照组。培养5天后开始加入成骨细胞诱导液诱导,每3天完全换液一次,共诱导7天。茜素红染色检测钙结节的形成,RT-PCR检测成骨细胞特异性产物骨桥蛋白基因的表达。结果:1. MSCs的生长特性和形态学观察:在采用单纯贴壁筛选法培养MSCs的5例标本中仅1例培养扩增得到MSCs,而且在P3代时已出现老化现象。而采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法的9例标本均成功分离培养得到MSCs。MSCs原代培养7-12天可铺满瓶底达80%以上,传代后细胞增殖更迅速,P3代5-7天即可长满瓶底达80%以上,细胞形态均匀一致。至P5代,MSCs的增殖逐渐变慢,并出现胞体变大,突起增多的老化现象。生长曲线示P3代MSCs 1-3天为潜伏期、3-5天呈对数增长期、5-7天进入平台期。成骨诱导2周后茜素红染色可见红色矿化结节。2. RA患者血清对MSCs增殖的影响:经浓度为10%的RA患者血清作用后的实验组MSCs A值为0.28±0.044,对照组10%浓度时为0.305±0.01(t=0.939,P=0.366);当血清浓度为30%时实验组A值为0.327±0.092,对照组浓度30%时为0.437±0.164(t=1.58,P=0.14)。相同浓度条件下,实验组与对照组之间的差异没有统计学意义。3.经RA患者血清作用后MSCs对T细胞增殖的影响:经RA患者血清培养的实验组MSCs A值为0.534±0.022,与T细胞共培养组为0.712±0.069。经健康体检者血清培养的对照组MSCs A值为0.465±0.019,与T细胞共培养组为0.71±0.083。单独T细胞培养组为0.508±0.053。实验组与对照组之间的差异没有统计学意义(t=0.417,P=0.717),实验组与对照组MSCs均可以抑制T细胞的增殖。4. RA患者关节液对MSCs增殖的影响:加入RA患者关节液培养的实验组MSCs,当关节液浓度为10%时的A值为0.234±0.029,30%时为0.227±0.065,50%时为0.194±0.059,对照组MSCs的A值为0.269±0.047。实验组与对照组间的差异有统计学意义(F=3.44,P=0.028)。组间两两比较示对照组与50%浓度组有差异(P=0.003),其余组间的差异均没有统计学意义,即当RA患者关节液浓度达到50%时,MSCs的增殖是受到抑制的。5. RA患者关节液对MSCs凋亡的影响:流式细胞仪分析显示经50%RA患者关节液作用后的实验组MSCs的凋亡比例为41.53%,对照组为45.5%,两者的差异没有统计学意义(χ2=0.256,P=0.613)。6. RA患者关节液对MSCs成骨诱导的影响:50% RA患者关节液培养5天的MSCs,经成骨诱导7天后与对照组MSCs相比,产生的矿化结节数量更多且体积更大、茜素红染色可见更多被染成红色的钙结节。进一步的RT-PCR实验证实经关节液培养的实验组MSCs经成骨诱导7天后就明显可见骨桥蛋白基因的表达,而未经关节液作用的对照组MSCs骨桥蛋白基因的表达量还很少。结论:1.采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法可以有效地分离培养扩增骨髓MSCs。2.活动期RA患者血清不会抑制外源性骨髓来源MSCs的增殖,也不会降低MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用。3. 50%浓度的RA患者关节液可抑制MSCs的增殖,但不是通过增加MSCs的凋亡。4.经RA患者关节液培养后的MSCs,其向成骨细胞分化的速度更快。

全文目录


中文摘要  4-9
英文摘要  9-16
引言  16-19
第一部分 骨髓来源 MSCs 的培养及鉴定  19-34
  1 材料与方法  19-26
  2 结果  26-30
  3 讨论  30-33
  4 结论  33-34
第二部分 RA 患者炎性环境对 MSCs 的影响  34-50
  1 材料与方法  34-41
  2 结果  41-46
  3 讨论  46-49
  4 结论  49-50
参考文献  50-55
综述 间充质干细胞治疗 RA 的基础研究进展  55-66
  参考文献  63-66
攻读学位期间发表文章情况  66-67
致谢  67-68
个人简历  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 全身性疾病 > 免疫性疾病 > 自身免疫性疾病、结缔组织疾病 > 类风湿性关节炎
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