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黑腐病诱导的甘蓝SSH文库构建及ESTs分析

作　者: 朱妍
导　师: 王超
学　校: 东北农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 甘蓝黑腐菌抑制差减杂交技术 SSH文库 ESTS
分类号: S436.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

结球甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)简称甘蓝。因耐寒、适应性强、易贮耐运、产量高、品质好等特点,现在我国各地普遍栽培。随着生产上大面积栽培,甘蓝的病虫害危害日益严重,引起甘蓝产量和品质的严重下降。甘蓝黑腐病是由野油菜黄单胞菌引起的一种世界性病害,是甘蓝栽培生产的主要限制因子。本研究采用了抑制差减杂交(SSH)技术构建SSH文库,应用EST技术与生物信息学分析技术,对甘蓝抗黑腐病相关基因进行分析,从基因水平上研究甘蓝抗病机制。为今后甘蓝抗黑腐病遗传育种奠定理论基础。本研究采用抗黑腐病的甘蓝自交系“A21”为试材,以接种黑腐病菌后6h、8h、12h、24h后的材料为试验方(Tester)和不接菌的材料为驱动方(Driver)构建SSH文库。通过反向Northern杂交、菌液PCR进行筛选后,对其中92个阳性克隆进行单向测序获得87个质量较好的EST序列。与GenBank数据库进行BLASTx和BLASTn比较分析,共有83条EST具有蛋白编码功能,占全部分析EST的95.4%。3条ESTS找不到任何同源序列,推测可能是一类新的基因或变异度较高的cDNA非编码区。与83条EST同源的推测蛋白质序列来自拟南芥、甜瓜、豇豆、小麦、水稻、葡萄、黄瓜、玉米、烟草、甘蓝、亚麻等物种。通过对获得的ESTS序列进行分析,发现了一些与信号传导有关的蛋白如serine/threonine kinase丝/苏氨酸激酶,MAP3K alpha protein kinase。一些与初级代谢有关的酶如peptidylprolyl isomerase肽基脯氨酰异构酶,malate dehydrogenase苹果酸脱氢酶等。putative rubisco activase核酮糖二磷酸羟化酶和叶绿素chlorophyll a/b-binding proteina/b结合蛋白等是与光合作用有关的蛋白。在本研究中,有8条ESTs与甘蓝和拟南芥的抗病基因类似物有部分同源性,应该是参与甘蓝抗黑腐病反应的重要基因。另外在所获得的ESTS中存在部分非生物胁迫诱导蛋白如heat shock protein 20 (hsp20)热休克蛋白,说明生物机体对外界的胁迫反应,存在某种协同机制。在获得的ESTS中还包括一些次生代谢、抗病和防御基因、蛋白质合成、能量代谢等基因,推测这些基础功能基因与甘蓝抗病机制相关。

黑腐病诱导的甘蓝SSH文库构建及ESTs分析

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