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二穗短柄草VERNALIZATION1基因的克隆与表达分析及小麦光周期反应的基因芯片分析

作　者: 徐建斌
导　师: 安海龙
学　校: 山东农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 春化作物二穗短柄草 BdVRN1 基因表达调控基因芯片
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 82次
引　用: 1次
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内容摘要

春化,是指低温对开花的促进作用,春化后的植物不会立刻开花,但会使植物茎端分生组织具有开花的潜能,是一种重要的生理学现象。麦类作物作为重要的粮食作物,其春化作用的分子机理相对于拟南芥来说尚不明确,而本身研究起来困难。二穗短柄草具有春化特性、易转化等特点,作为一个新型禾本科模式植物被用于本实验进行VRN1基因功能的研究。我们从短柄草中分离出了麦类作物VRN1基因的同源基因,并命名为BdVRN1,其编码序列含有保守的MADS-box和K-box功能域,是MADS-box基因家族成员。通过分析发现BdVRN1基因的非编码序列可能具有重要春化和光周期的调控位点(启动子)和调控结构(内含子)。实时定量和半定量RT-PCR的结果显示,短柄草各植物器官在春化处理后,BdVRN1基因的表达量都有所提高,说明在不同植物器官中BdVRN1都受到了春化诱导;通过不同日照长短春化处理可以发现,无论是长日照还是短日照条件下,BdVRN1基因在春化过程中表达量都呈上升趋势,说明在长日照和短日照条件下BdVRN1基因的表达都能受到春化作用的诱导,但是在放回温室后长日照条件下的BdVRN1基因表达量继续上升,短日照条件下的BdVRN1基因表达量则被抑制,而这两种条件下BdVRN1基因表达量的不同可能最终影响了短柄草的花期以及植株的形态,揭示了BdVRN1基因在春化途径开花调控中起到了重要作用;同时,短柄草BdVRN1基因在不同日照长度条件下的表达方式有所差别,即短柄草BdVRN1基因的表达受到了光周期作用的调控,这种BdVRN1基因表达量的不同可能最终影响了短柄草的开花时间,揭示了BdVRN1基因在光周期途径开花调控中也起到了重要作用;此外,通过对BdVRN1基因昼夜表达调控的分析,表明该基因在不同光照条件下是受到生物节律性调控。以上结果都说明了短柄草的BdVRN1基因受到了春化作用和光周期作用的双重调控,BdVRN1基因的表达量与开花时间紧密相连,表现出一定的相关性,所以BdVRN1基因有可能是影响短柄草开花的重要基因。小麦在短日照转移长日照时存在一个由长日照诱导产生的成花信号及信号转导途径以启动开花程序,利用Agilent基因芯片(上海伯豪)分析这一过程可以发现差异表达基因,从而鉴定光周期途径的早期反应基因。根据芯片中基因表达量的变化,筛选出小麦光周期候选基因,通过芯片数据,信号的探针共43603组,用cluster3.0软件进行筛选后共有2173组Fold change≥2的有效数据,占芯片探针总数的5%左右。再根据功能分类,与光周期相关序列分为3组,①受光周期影响持续上调(234个);②受光周期影响上调后又下调(104个);③受光周期影响下调(102个),并对每组数据进行功能分类,推测这些基因可能参与了响应小麦光周期信号的过程。

全文目录

中文摘要  10-12
Abstract  12-14
1 引言  14-32
  1.1 开花  14-19
    1.1.1 光周期途径  16
    1.1.2 自主开花途径  16-17
    1.1.3 赤霉素途径  17-18
    1.1.4 春化作用途径  18-19
  1.2 春化作用的背景  19-21
    1.2.1 春化作用的发现  20
    1.2.2 春化作用的内容  20-21
    1.2.3 春化素与赤霉素  21
  1.3 春化作用的机理  21-26
    1.3.1 麦类植物春化作用的研究进展  21-22
    1.3.2 VRN1、VRN2 和VRN3 共同控制了麦类作物的春化作用  22-24
    1.3.3 VRN1 在春化过程中的重要作用  24-25
    1.3.4 春化作用的表观遗传学  25-26
  1.4 短柄草  26-29
  1.5 小麦光周期反应的基因芯片  29-31
    1.5.1 小麦光周期途径  29
    1.5.2 基因芯片技术  29-30
    1.5.3 基因芯片的应用  30-31
    1.5.4 本实验的基因芯片  31
  1.6 本研究的目的及意义  31-32
2 材料与方法  32-48
  2.1 实验材料  32-33
    2.1.1 植物材料及生长条件  32
    2.1.2 菌株和载体  32
    2.1.3 酶及相关生化试剂  32-33
    2.1.4 PCR 引物  33
    2.1.5 培养基  33
  2.2 实验方法  33-48
    2.2.1 总RNA 的提取  33-34
    2.2.2 反转录成cDNA  34-35
    2.2.3 PCR 扩增  35-36
    2.2.4 DNA 目的片段的回收  36-37
    2.2.5 连接克隆载体  37-38
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  38-39
    2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的转化  39-40
    2.2.8 质粒DNA 的提取  40-42
    2.2.9 酶切  42
    2.2.10 DNA 测序  42-43
    2.2.11 hiTAIL-PCR  43
    2.2.12 表达载体的构建  43-44
    2.2.13 半定量和定量RT-PCR  44-45
    2.2.14 茎尖取材  45
    2.2.15 叶片取材  45-46
    2.2.16 基因芯片取材  46
    2.2.17 组织培养  46-48
3 结果与分析  48-79
  3.1 短柄草BdVRN1 基因的分离  48-49
  3.2 BdVRN1 基因的共线性分析  49-50
  3.3 BdVRN1 基因的氨基酸序列分析  50-51
  3.4 BdVRN1 基因的同源序列比较  51-52
  3.5 春化相关基因的系统进化树  52-54
  3.6 BdVRN1 基因组的结构分析  54-55
  3.7 BdVRN1 基因的上游调控序列分析  55-56
  3.8 BdVRN1 基因在长日照春化条件下的表达分析  56-58
  3.9 BdVRN1 基因在短日照春化条件下的表达分析  58-60
  3.10 BdVRN1 基因春化作用前后在不同器官中的表达分析  60-61
  3.11 BdVRN1 基因生物节律性的表达分析  61-64
  3.12 BdVRN1 基因在不同光周期条件下的表达分析  64-67
  3.13 BdVRN1 基因的表达载体构建  67-68
  3.14 短柄草的组培转化  68-69
  3.15 短柄草顶端分生组织发育形态的分析  69-70
  3.16 小麦光周期反应的基因芯片分析  70-79
4 讨论  79-84
  4.1 VRN1 基因的功能  79-80
  4.2 MADS-box 基因在春化作用中的功能  80
  4.3 春化处理的表观遗传学调控  80-81
  4.4 短柄草BdVRN1 基因的功能  81-83
    4.4.1 BdVRN1 基因是小麦VRN1 的同源基因  81
    4.4.2 BdVRN1 基因受到春化作用的调控  81-82
    4.4.3 BdVRN1 基因的生物节律性调控  82
    4.4.4 BdVRN1 基因受到光周期作用的调控  82
    4.4.5 BdVRN1 基因在开花方面的功能  82-83
  4.5 小麦光周期反应基因的筛选与分析  83-84
5 结论  84-85
参考文献  85-98
附录  98-104
攻读学位期间发表论文情况  104-105
致谢  105

二穗短柄草VERNALIZATION1基因的克隆与表达分析及小麦光周期反应的基因芯片分析

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