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Bevacizumab对体外培养的猪视网膜色素上皮细胞生物学特性的研究

作　者: 温晓英
导　师: 郝玉华
学　校: 河北医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 视网膜色素上皮细胞贝伐单抗增生细胞周期和凋亡形态吞噬功能移行
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:Bevacizumab进行玻璃体腔内注射治疗眼内各种新生血管性疾病,目前已经成为眼科领域的新热点,有关报道(1,2,3)相继发表于世,患者的视功能均有不同程度恢复和提高,然而对于其远期疗效,目前各国学者还没有进行大量的长期随访和前瞻性随机临床研究。当一种药物应用于局部,我们应该了解其对靶部位不同组织有无潜在毒性影响,有关Bevacizumab对体外培养的猪视网膜色素上皮细胞生长的影响,国内外临床和基础研究较少。本实验通过体外培养猪RPE细胞来观察Bevacizumab对视网膜色素上皮细胞的影响。方法:1猪视网膜色素上皮细胞培养1.1摘取猪眼球,去除眼前节和视网膜神经层,用胰酶消化法培养猪原代RPE细胞。1.2把剥离下来的视网膜神经层以1000r/min-1离心5min,加少许培养液,轻吹,吸出上层悬浮的颜色较深的液体,接种于培养瓶中。1.3细胞鉴定:免疫荧光,透射电镜两种方法对RPE细胞进行鉴定。2 Bevacizumab对体外培养的猪视网膜色素上皮细胞毒性作用2.1把培养的第3代RPE细胞接种于96孔板中,分别加入终浓度为0,0.125,0.5,1.0,1.25,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分别于12h,24h,48h,72h后,MTT比色法测定药物对RPE增生的影响。2.2根据MTT结果,将培养的第3代细胞中加入终浓度为2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,培养72小时后,流式细胞术检测Bevacizumab对RPE细胞凋亡和细胞周期的影响。2.3第三代RPE细胞,加入终浓度为2.0mg/ml的bevacizumab作用72h后,透射电镜观察RPE细胞形态的改变。3 Bevacizumab对猪视网膜色素上皮(RPE)细胞吞噬和移行功能的影响3.1 ROS制备和FITC荧光标记,细胞色素的制备室温下,于暗处用终浓度为10ug/ml的FITC液孵育提取的ROS1小时,然后以细胞培养液调整浓度为l×107 /ml。原代细胞培养时,在第二次换液时,吸取培养瓶下部1/2培养液,用培养液稀释,-20℃冻存备用。3.2 RPE细胞的培养及标记采用胰蛋白酶消化法。把培养的第3代RPE细胞接种于24孔板中,分别加入终浓度为0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分别于12h,24h,48h,72h后,用含有终浓度为40ug/mlSR的生长液孵育RPE细胞36小时。3.3吞噬动力学观察向每个培养孔(24孔板)中加入l×107 /ml的FITC-ROS50ul,进行孵育24h。将孵育液吸出,以4℃的无血清DMEM冲洗二次,以终止吞噬。在荧光显微镜下观察吞噬量。3.4非特异性吞噬实验采用胰蛋白酶消化法,把培养至无色素的第7代RPE细胞接种于96孔板中,分别加入终浓度为0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab ,分别于12h,24h,48h,72h后,将培养液吸出,每孔加入含色素的培养液60ul,24h后洗净,用405nm波长的酶联免疫检测仪检测RPE吞噬色素量。3.5检测对RPE细胞移行能力的影响将培养的第3代RPE细胞以5×104个每孔接种于24孔细胞培养板上,分别加入终浓度为0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分别于12h,24h,48h,72h后,将培养液吸出,制造RPE细胞损伤模型,无血清培养48h,HE染色,计数进入刮痕区的细胞数。结果:1.体外培养的猪原代RPE细胞生长良好,有的呈集落式生长,细胞呈不规则形,接近融合时近六边形,传代稳定,透射电镜表明细胞内含大量色素,免疫荧光鉴定抗角蛋白抗原阳性;2.通过MTT法检测,2.0-2.5mg/ml浓度范围内,与对照组比较,Bevacizumab作用72h后RPE细胞生长均有明显抑制(p<0.05),且呈浓度依赖性;3.流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Bevacizumab组S期细胞较对照组减少,细胞凋亡与对照组无差异;4.透射电子显微镜观察细胞的超微结构,Bevacizuman组细胞微绒毛减少,细胞质内出现空泡和髓鞘样变性;5.与对照组相比,Bevacizumab的任何浓度和任何时间段对RPE细胞的特异性吞噬和非特异性吞噬都没有影响;6. Bevacizumab在2.0-2.5mg/ml浓度范围内,与对照组比较,Bevacizumab作用48h后可明显抑制RPE细胞移行。结论:1.本研究成功的培养了猪原代RPE细胞,并最大化的收集了RPE细胞,细胞保持正常增殖能力,免疫荧光鉴定抗角蛋白抗原阳性,所采用方法与人RPE细胞培养相近,来源,取材不受限制,操作更方便,可以在某些方面代替人RPE细胞来进行实验方面的研究工作;2.在观察Bevacizumab对RPE细胞毒性的影响中,浓度达到2.0mg/ml时才表现出对RPE细胞增殖的影响;3.在Bevacizumab对RPE细胞功能的影响中,只有较高浓度的药物才对移行功能造成影响。实验证明贝伐单抗低浓度还是比较安全的。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
研究论文 Bevacizumab(avastin)对猪视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响  12-50
  引言  12-13
  第一部分猪视网膜色素上皮细胞的培养的研究  13-25
    前言  13
    材料与方法  13-16
    结果  16-17
    附图  17-20
    讨论  20-22
    小结  22-23
    参考文献  23-25
  第二部分 Bevacizumab(avastin)对猪视网膜色素上皮(RPE)细胞的毒性作用研究  25-36
    前言  25
    材料与方法  25-27
    结果  27-28
    附图  28-32
    附表  32-33
    讨论  33-34
    小结  34-35
    参考文献  35-36
  第三部分探讨Bevacizumab(avastin)对猪视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能研究  36-50
    前言  36
    材料与方法  36-41
    结果  41-42
    附图  42-46
    附表  46-47
    讨论  47-48
    小结  48-49
    参考文献  49-50
综述 Bevacizumab 对眼组织安全性的研究进展  50-59
致谢  59-60
个人简历  60

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