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目的:本实验拟通过小鼠原代肝细胞,检测异烟肼和利福平对小鼠原代肝细胞CYP2E1和CYP3A活性的影响,探讨异烟肼和利福平单用及合用引起肝毒性的机制。并通过检测部分中药对CYP2E1和CYP3A活性的影响,考察其保肝作用。方法:1小鼠原代肝细胞的制作和培养昆明种小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg体重)麻醉,固定,打开腹腔,分离下腔静脉和肝门静脉,从下腔静脉插针并固定,用37℃无菌灌流液Ⅰ(NaCl 160.8 mmol/L, KCl 3.15 mmol/L, Na2HPO4·12H2O 0.7 mmol/L, Hepes 33 mmol/L, pH 7.4)灌流,待肝脏体积增大,肝叶变白时剪断肝门静脉,灌流5分钟后改用37℃无菌灌流液Ⅱ(含0.1 g/LⅣ型胶原酶和0.566 g/L CaCl2的灌流液Ⅰ)灌流5分钟,将肝剪下放入4℃的培养基(Williams′E Medium 10.8 g/L,NaHCO3 2.2 g/L,10%胎牛血清,青霉素100 U/mL,链霉素100 U/mL)中,用无菌镊子将肝被膜剥离,并不断抖动以抖落肝细胞,细胞悬液以160目滤网过滤,600 r/min低温离心3分钟后弃上清,用培养基洗涤,重复2次。0.4%台盼蓝染色,血细胞计数板测定肝细胞存活率及细胞密度。存活率>85%用于试验,将肝细胞以2×105/mL接种于预先铺有自制鼠尾胶原的24孔培养板,每孔1mL,置37℃,5% CO2的培养箱中培养,24小时后首次换液,以后隔一天换一次液。2细胞培养液中乳酸脱氢酶活性的测定药物处理48小时后,分别收集各组细胞培养上清液,-20℃保存待测。用乳酸脱氢酶试剂盒,采用比色法测定样品在440 nm的吸光度值,并计算乳酸脱氢酶的活性,细胞上清液中乳酸脱氢酶的活性代表药物对细胞的损伤作用。3 HPLC-MS法测定细胞培养液中对硝基酚和咪达唑仑的浓度色谱条件:色谱柱:Gemini C18分析柱(2.0×50 mm,5μm),Phenomenex公司;C18保护柱(3.0×4.0 mm,5μm),Phenomenex公司;流动相:乙腈-水(含0.2%冰醋酸)=60:40;流速:0.2 mL/min;柱温:30℃;进样量:10μL。质谱条件:电喷雾(ESI)离子化源,选择离子监测(SIM)模式。对硝基酚检测条件:毛细管电压2KV;氮气流速10 L/min,雾化气压力为210 kPa,干燥气温度为350℃;负离子方式检测,碎片电压为150V,m/z [138.1]-。咪达唑仑检测条件:毛细管电压3KV;氮气流速10 L/min,雾化气压力为210 kPa,干燥气温度为350℃;正离子方式检测,碎片电压为50V,m/z [326.0]+。4分组及加药处理4.1异烟肼和利福平对肝细胞乳酸脱氢酶释放的影响将肝细胞以2×105/mL的密度接种于24孔板,细胞分组为空白对照组,异烟肼组,利福平组,异烟肼+利福平组。接种后培养第3天,分别加入含有空白培养基,异烟肼(150μg/mL,500μg/mL,1000μg/mL),利福平(100μg/mL,200μg/mL,300μg/mL),利福平+异烟肼(100μg/mL+50μg/mL,200μg/mL+100μg/mL,300μg/mL+150μg/mL)的含药培养基,每个浓度6孔,培养48 h后,收集细胞培养上清液,用于乳酸脱氢酶的测定。4.2异烟肼和利福平对肝细胞CYP2E1和CYP3A活性的影响将肝细胞分为对照组,异烟肼组(100μg/mL),利福平组(200μg/mL),利福平+异烟肼组(200μg/mL+100μg/mL)。对照组加入1 mL培养液,药物处理组加入含有相应浓度药物培养液1 mL,每组12孔,CYP2E1和CYP3A各6孔,加好各种浓度的药物后,把细胞培养板放入培养箱中孵育2天,再分别加入CYP2E1和CYP3A的相应底物对硝基酚(200 ng/mL)和咪达唑仑(200 ng/mL)反应2 h,反应终止后将细胞培养液吸出,离心取上清,用HPLC–MS测定底物的浓度,底物浓度的减少代表CYP2E1和CYP3A的活性的变化。4.3三七皂苷和柑橘素对异烟肼和利福平合用增加肝细胞乳酸脱氢酶释放的影响将细胞分为8组,分别为空白对照组,利福平(200μg/mL)+异烟肼(100μg/mL)组,利福平+异烟肼+柑橘素(5μg/mL)组,利福平+异烟肼+柑橘素(50μg/mL)组,利福平+异烟肼+柑橘素(500μg/mL)组,利福平+异烟肼+三七皂苷(20μg/mL)组,利福平+异烟肼+三七皂苷(100μg/mL)组,利福平+异烟肼+三七皂苷(500μg/mL)组,每组6孔,药物处理48 h后,收集细胞培养上清液,用于乳酸脱氢酶活性的检测。4.4三七皂苷对肝细胞CYP2E1活性的影响将细胞分为空白对照组,利福平(200μg/mL)+异烟肼(100μg/mL)组,利福平+异烟肼+三七皂苷(20μg/mL)组,利福平+异烟肼+三七皂苷(100μg/mL)组,利福平+异烟肼+三七皂苷(500μg/mL)组,每组6孔。加好各种浓度的药物后,把细胞培养板放入培养箱中孵育2天,加入CYP2E1的底物对硝基酚(200 ng/mL)反应2h,反应终止后将细胞培养液吸出,离心取上清,用HPLC–MS测定对硝基酚的浓度。4.5柑橘素对肝细胞CYP3A活性的影响将细胞分为空白对照组,利福平(200μg/mL)+异烟肼(100μg/mL)组,利福平+异烟肼+柑橘素(5μg/mL)组,利福平+异烟肼+柑橘素(50μg/mL)组,利福平+异烟肼+柑橘素(500μg/mL)组。加好各种浓度的药物后,把细胞培养板放入培养箱中孵育2天,加入CYP3A的底物咪达唑仑(200 ng/mL)反应2 h,反应终止后将细胞培养液吸出,离心取上清,用HPLC–MS测定咪达唑仑的浓度。5数据处理与统计分析数据以均数±标准差(mean±SD)表示,统计分析采用SPSS 13.0软件处理,组间差异采用成组设计的t检验,多组间比较采用单因素方差分析继于Dunnett t test;量效关系采用二元变量相关分析,计算Pearson相关系数,统计结果以P<0.05为具有显著性差异。结果:1异烟肼和利福平对小鼠原代肝细胞乳酸脱氢酶释放的影响与对照组比较,异烟肼中、高浓度组乳酸脱氢酶活性显著升高(P<0.05, P<0.01)。利福平高浓度组乳酸脱氢酶活性显著升高(P<0.05)。利福平和异烟肼合用中、高浓度组乳酸脱氢酶活性显著升高(P<0.05, P<0.01),利福平和异烟肼合用浓度与乳酸脱氢酶活性的Pearson相关系数r =0.708(P<0.05)。药物处理后细胞培养液中乳酸脱氢酶的活性能反映细胞的损伤程度。结果表明异烟肼和利福平均对小鼠原代肝细胞有损伤作用,两药合用时在较低浓度即可引起肝细胞损伤。2利福平和异烟肼对小鼠原代肝细胞CYP2E1和CYP3A活性的影响本实验结果显示,与对照组比较,加入药物处理48 h后,单用异烟肼组与利福平和异烟肼合用组CYP2E1活性明显增加(P<0.05)。与对照组比较,单用利福平组与利福平和异烟肼合用组处理48 h,CYP3A活性显著增加(P<0.05)。3三七皂苷和柑橘素对小鼠原代肝细胞乳酸脱氢酶释放的影响三七皂苷与利福平和异烟肼同时加入肝细胞培养48 h后,与利福平和异烟肼合用组比较,三七皂苷低、中、高浓度组乳酸脱氢酶释放均明显降低(P<0.05, P<0.01, P<0.01)。柑橘素与利福平和异烟肼共同培养48 h后,与利福平和异烟肼合用组比较,柑橘素中、高浓度组细胞乳酸脱氢酶释放明显降低(P<0.01, P<0.01)。4三七皂苷对小鼠原代肝细胞CYP2E1活性的影响三七皂苷与利福平和异烟肼同时加入细胞培养48 h后,与对照组比,利福平和异烟肼合用组CYP2E1活性明显升高(P<0.01)。与合用组比较,三七皂苷中、高浓度组CYP2E1活性明显降低(P<0.01, P<0.01)。5柑橘素对小鼠原代肝细胞CYP3A活性的影响柑橘素和利福平和异烟肼同时加入细胞培养48 h后,与对照组比较,合用组CYP3A活性明显升高(P<0.05)。与合用组比较,柑橘素高浓度组CYP3A活性明显降低(P<0.05)。结论:1异烟肼和利福平单用及合用均能导致小鼠肝细胞损伤,两药合用时较单用时肝损伤作用明显增加。2异烟肼和利福平单用或合用可不同程度诱导小鼠原代肝细胞CYP2E1和CYP3A的活性,推测此为异烟肼和利福平单用及合用时引起肝细胞损伤的机制之一。3不同浓度的三七皂苷和柑橘素可分别降低小鼠原代肝细胞内CYP2E1和CYP3A的活性,并能抑制异烟肼和利福平合用导致的肝细胞乳酸脱氢酶释放增加。对肝细胞有保护作用。对特定肝药酶的抑制作用可能是两种药物肝保护作用的机制之一。
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