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（+）儿茶素对神经元缺血损伤的保护作用及其对酸敏感离子通道影响的研究

作　者: 张建东
导　师: 张艳
学　校: 郑州大学
专　业: 药理学
关键词: (+)儿茶素 脑缺血 乳酸脱氢酶 一氧化氮合酶 酸敏感离子通道
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：脑缺血损伤是困扰人类的疾病之一,其病理病生机制较为复杂。近年来研究显示ASICs(酸敏感离子通道)与脑缺血发生时的酸中毒和钙超载有着密切关系。儿茶素类是绿茶当中主要的茶多酚类活性物质,具有保护脑缺血等多种因素导致的神经元损伤的作用,但作用机制尚不明确。本研究的目的在于进一步研究(+)儿茶素类药物对缺血再灌注损伤的保护作用和酸中毒损伤的保护作用,利用全细胞膜片钳方法来考察儿茶素类药物是否作用于酸敏感离子通道电流,从而为(+)儿茶素治疗脑缺血疾病提供新的依据。方法：新生大鼠皮层神经元原代培养,加入阿糖胞苷抑制非神经元的生长,采用NSE(神经元特异性烯醇化酶)免疫化学染色鉴定神经元纯度。利用MTT比色法研究神经元的细胞存活率与酸损伤时间的关系。分别建立酸损伤模型和OGD/R(氧糖剥夺/再恢复)损伤模型,同时设立阿米洛利(10μmol/1)阳性对照组、正常对照组、(+)儿茶素A、B、C、D (1、0.5、0.25、0.1mmol/1)药物处理组,模型损伤组,MTT比色法检测各组细胞存活率,形态学观察比较,检测各个组NOS,LDH的释放。全细胞膜片技术观察(+)儿茶素对酸诱导的大鼠皮层神经元ASICs的电流的影响。结果：1 (+)儿茶素对酸环境下皮层神经元损伤的保护作用(1)：皮层神经元酸环境下处理4h,各组的细胞存活率如下(%)：正常组(100±0.00),模型组(29.13±1.89),amiloridum组(48.07±4.27),(+)-catechinA组(37.30±6.26),(+)-catechin B组(42.66±1.41),(+)-catechin C组(43.24±2.99),(+)-catechin D组(41.94±2.45)。与正常组相比,模型组和药物处理组细胞存活率明显下降(P<0.01)；与模型组相比,药物处理组细胞存活率均可显著提高(P<0.05)；(+)-catechin A组和(+)-catechin D组细胞存活率明显低于amiloridum组(P<0.05)；(+)-catechin B组和(+)-catechin C组细胞存活率与amiloridum组比较无明显差异(P>0.05)(2)：皮层神经元酸环境下处理4h,各组的细胞外液LDH含量如下(U/L)：正常组(112.9+9.62),模型组(463.7±13.85),amiloridum组(288.2±20.10),(+)-catechinA组(314.4±14.74), (+)-catechin B组(336.3±14.69), (+)-catechin C组(344.8±26.24), (+)-catechin D组(381.2±15.66)。模型组和药物处理组细胞外液中的LDH含量与正常组相比明显升高(P<0.01)；与模型组相比,药物处理组细胞外液中LDH含量均可显著降低(P<0.05)；(+)-catechin C组和(+)-catechin D组LDH含量明显高于amiloridum组(P<0.05)；(+)-catechin A组和(+)-catechin B组细胞外液中LDH含量与amiloridum组比较无明显差异(P>0.05)(3)：皮层神经元酸环境下处理4h,各组的细胞外液NOS含量如下(U/m1)：正常组(0.67±0.098),模型组(1.75±0.095),amiloridum组(1.15±0.087), (+)-catechinA组(1.23±0.190),(+)-catechin B组(1.28±0.092),(+)-catechin C组(1.43±0.140),(+)-catechin D组(1.49±0.085)。模型组和药物处理组细胞外液中的NOS含量与正常组相比明显升高(P<0.01)；与模型组相比,药物处理组细胞外液中NOS含量均可显著降低(P<0.05)；(+)-catechin C组和(+)-catechin D组LDH含量明显高于amiloridum组(P<0.05)；(+)-catechin A组和(+)-catechin B组细胞外液中LDH含量与amiloridum组比较无明显差异(P>0.05)。2(+)儿茶素对氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用(1)：皮层神经元经氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤,各组的细胞存活率如下(%)正常组(100±0.00),模型组(35.27±3.41),amiloridum组(48.50±1.94),(+)-catechin A组(52.53±3.79),(+)-catechin B组(57.22±2.99),(+)-catechin C组(58.68±1.80),(+)-catechin D组(50.75±2.29)。模型组和药物处理组的细胞存活率比正常组相比显著下降(P<0.01)；与模型组相比,药物处理组的细胞存活率均可显著提高(P<0.05)；(+)-catechin B组和(+)-catechin C组细胞存活率明显高于与阿米洛利组相比(P<0.05)；而(+)-catechin A组和(+)-catechin D组于与阿米洛利组相比无显著差异(P>0.05)(2)：皮层神经元经氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤,各组的细胞外液LDH含量如下(U/L)：正常组(151.6±8.58),模型组(672.3±28.51),amiloridum组(398.5±23.82),(+)-catechin A组(385.7±29.08),(+)-catechin B组(406.3±41.88),(+)-catechinC组(434.8±33.27),(+)-cateChin D组(457.9±19.36)。模型组和药物处理组细胞外液中的LDH含量与正常组相比明显升高(P<0.01)；与模型组相比,药物处理组细胞外液中LDH含量均可显著降低(P<0.05)；(+)-catechin A组、(+)-catechin B组、(+)-catechin C组细胞外液中LDH含量和amiloridum组相比无显著差异(P>0.05)；(+)-catechin D组细胞外液中LDH含量明显高于amiloridum组(P<0.05)(3)：皮层神经元经氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤,各组的细胞外液LDH含量如下(U/m1)：正常组(1.04±0.125),模型组(3.05±0.163),amiloridum组(2.25±0.111),(+)-catechin A组(1.84±0.147),(+)-catechin B组(1.87±0.201),(+)-catechin C组(2.26±0.266),(+)-catechin D组(2.42±0.092)。模型组和药物处理组细胞外液中的NOS含量与正常组相比明显升高(P<0.01)；与模型组相比,药物处理组细胞外液中NOS含量均可显著降低(P<0.05)；(+)-catechin C组、(+)-catechinD组和amiloridum组相比无显著差异(P>0.05)；(+)-catechinA组(+)-catechinB组细胞外液中NOS含量明显低于amiloridum组(P<0.05)3(+)儿茶素对酸诱导的ASICs电流的影响10μmol/1 amiloridum和500umol/1(+)-catechin与在不加药物条件pH6.0刺激诱发的ASICs电流幅值均明显下降(P<0.01),其中10μmol/1 amiloridum作用下电流下降至65.2±4.13%(n=8-12),而500μmol/1(+)-catechin下降至81.7±3.74％(n=8-12).500μmol/1(+)-catechin电流幅值明显高于10μmol/1 amilo ridum(P<0.05).结论：1.皮层神经元经酸环境和缺氧缺糖再恢复损伤时细胞存活率显著降低,(+)-catechin可以明显提高两种模型下的细胞存活率,降低LDH释放和NOS含量。2.(+)-catechin的神经保护作用机制可能包括改善脑组织能量代谢,拮抗NO介导的神经毒性,抑制ASICs通道的开放等。

全文目录


摘要  4-8
Abstract  8-13
目录  13-16
主要缩略词对照  16-18
前言  18-19
1 实验材料  19-21
  1.1 实验动物  19
  1.2 药品与试剂  19-20
  1.3 仪器设备  20
  1.4 溶液的配制  20-21
2 实验方法  21-25
  2.1 大鼠皮层神经元的体外培养与鉴定  21-22
    2.1.1 皮层神经元原代培养  21-22
    2.1.2 NSE(神经元特异性烯醇化酶,Neuronspecific enolase,)免疫化学染色法对神经元纯度鉴定  22
  2.2 (+)儿茶素对酸环境下神经元损伤的保护作用的研究  22-23
    2.2.1 酸环境下皮层神经元的细胞存活率与时间依赖性的研究  22-23
    2.2.2 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h的一般形态学观察和细胞存活率的测定  23
    2.2.3 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4hLDH含量的测定  23
    2.2.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4hNOS含量的测定  23
  2.3 (+)儿茶素对氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用  23-24
    2.3.1 (+)儿茶素对氧糖剥夺再恢复皮层神经元酸损伤的一般形态学观察和细胞存活率的测定  23-24
    2.3.2 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复损伤LDH含量的测定  24
    2.3.3 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4hNOS含量的测定  24
  2.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸敏感离子通道电流的影响  24-25
    2.4.1 电生理记录方法  24-25
    2.4.2 药品给药方法  25
    2.4.3 信号采集  25
3 统计学分析  25
4 实验结果  25-37
  4.1 新生大鼠皮层神经元的体外培养与纯度鉴定  25-26
    4.1.1 大鼠皮层神经元原代培养的形态学观察  25
    4.1.2 NSE免疫化学染色对神经元纯度鉴定  25-26
  4.2 (+)儿茶素对酸环境下神经元损伤的保护作用  26-31
    4.2.1 酸环境下皮层神经元的细胞存活率与时间依赖性  26-27
    4.2.2 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h细胞存活率的影响  27-28
    4.2.3 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h LDH释放的影响  28-29
    4.2.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h NOS含量的影响  29-30
    4.2.5 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤形态学观察比较  30-31
  4.3 (+)儿茶素对氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用  31-35
    4.3.1 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤细胞存活率的影响  31-32
    4.3.2 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤LDH释放的影响  32-33
    4.3.3 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤细胞外液NOS含量的影响  33-35
  4.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸敏感离子通道电流的影响  35-37
    4.4.1 皮层神经元ASICs电流特点  35-36
    4.4.2 (+)-catechin对ASICs电流的影响  36-37
5 讨论  37-39
6 结论  39-40
附录 图片  40-42
参考文献  42-44
综述  44-61
  脑缺血与非谷氨酸依赖性阳离子通道的研究进展  44-61
    1 酸敏感离子通道与脑缺血损伤  44-46
      1.1 酸敏感离子通道  44-45
      1.2 ASIC1a的生理学及药理学特点  45
      1.3 ASIC1a/2a与脑缺血损伤  45-46
    2 瞬时受体电位通道与脑缺血损伤  46-50
      2.1 瞬时受体电位通道  46-47
      2.2 TRPM7的生理学特点  47-48
      2.3 TRPM2的生理学特点  48
      2.4 TRPM2/7与脑缺血损伤  48-50
    3 NCX与脑缺血损伤  50-53
      3.1 钠钙交换体的生理学特点  50
      3.2 钠钙交换体与脑缺血损伤  50-53
    参考文献  53-61
致谢  61-62
个人简历  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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