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放线菌发酵液中端粒酶抑制剂的高通量筛选

作　者: 张慧敏
导　师: 庞建新
学　校: 南方医科大学
专　业: 药理学
关键词: 放线菌发酵液端粒酶抑制剂酵母三杂交系统高通量筛选端粒酶抑制剂筛选模型 96孔板
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景和目的端粒是染色体末端的重复碱基序列,和DNA保护性蛋白一起,就象鞋带末端的金属结,能防止DNA降解或异常重组。正常细胞复制时,由于DNA聚合酶不能完整复制线型的DNA末端,端粒在每次细胞分裂后将缩短50-100 bp,当缩短到一定程度时,DNA将变得不再稳定,螺旋解开,细胞则停止分裂,开始衰老或死亡。这是正常细胞自身遗传程序决定的衰老和死亡的原因,而恶性肿瘤细胞因为激活端粒酶(telomerase),能把端粒缩短的部分补上,细胞分裂后端粒并不缩短,这是肿瘤细胞永生化生长的重要前提条件,也使得端粒酶成为识别肿瘤细胞和正常细胞的重要标志。由于90%以上的恶性肿瘤细胞都激活端粒酶,端粒酶特异抑制剂有可能是广谱的抗肿瘤药。因此,筛选和发现端粒酶抑制剂是寻找抗肿瘤新药的重要途径之一端粒酶有活性的最小组成单位是端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)和起模板作用的端粒酶RNA (human Telomerase RNA,hTR),体外只要重组这两部分就能重构端粒酶活性。而hTERT和hTR的结合,就象酶和底物的结合,在细胞周期S期结合,表现出端粒酶活性,其它期又分开,端粒酶无活性。这说明hTR-hTERT结合是可逆的,容易受抑制剂的影响。因此,如果筛选模型是针对hTR-hTERT的结合,就能大大提高筛选的特异性。根据以上理论,本实验组采用了端粒酶抑制剂酵母三杂交筛选模型。该模型是在酵母三杂交原理的基础上,将端粒酶的主要成分即hTERT和hTR的易结合片断导入酵母菌L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2,建立的针对hTR-hTERT结合的筛选模型。本实验利用该模型对2000多株放线菌发酵液样品高通量筛选端粒酶特异抑制剂。方法1.筛选模型的验证本实验室持有3种基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2/hTR126-451/hTERT292-608aa, L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2/ hTR240-450/hTERT292-608aa和L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2/hTR(m)/hTERT292-952aa,这3种模型是以酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2转染含有hTERT和hTR片断的质粒构建的,。若筛选模型存放过久或保存不当,质粒易丢失。因此在筛选前,需对筛选模型进行验证。在本实验中分别采用了酵母菌液PCR法、3-AT抗性分析、β-半乳糖苷酶活性分析等方法对这3种筛选模型进行验证。2.放线菌发酵液样品库的制备2000多株不同编号的放线菌样品(经发酵的米饭)0.3g分别置于5ml贴有标签的青霉素瓶内,用50%的乙醇3ml浸泡,在室温下经摇床振荡24h后过滤,收集滤过液置于贴有相同标签的青霉素瓶内,4℃冰箱保存备用。3.确定合适的筛选条件由于酵母菌细胞壁较厚,通透性差,需要延长培养时间以促使药物进入细胞,但培养时间过长,若起始筛选浓度太大,酵母菌生长就会过早进入平台期,使得培养时间缩短而不利于筛选。因此在筛选前需选择合适的筛选起始培养浓度。同时由于实验中使用的筛选模型是以酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2转染含有hTERT和hTR片断的质粒构建的,而菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2是一种啤酒酵母,酒精对其生长有抑制作用。但实验所筛选的放线菌发酵液样品的溶出液为50%酒精,因此筛选前,还需确定合适的放线菌发酵液样品中酒精的绝对浓度,以避免或最大限度消除酒精对筛选的影响。在96孔细胞板中,设置酵母菌浓度梯度,每培养12小时测量酵母菌液OD595nm值,并由测量结果绘制酵母菌生长曲线,根据酵母生长曲线选择合适的筛选起始培养浓度。然后再采取相同方法确定合适的放线菌发酵液样品剂量。4.高通量放线菌发酵液样品筛选确定酵母菌起始培养浓度和放线菌发酵液样品剂量后,用筛选模型酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2/hTR 126-451/hTERT292-608aa、L40ura3/pHyblex/ Zeo-MS2/hTR240-450/hTERT292-608aa和L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2/hTR(m)/ hTERT292-952aa分别对2000多株放线菌发酵液样品进行高通量筛选。实验中使用96孔板,每孔含10μl放线菌发酵液样品和190μl模型酵母菌菌液,并做溶剂对照和空白对照,每培养12小时用酶标仪测量并记录酵母菌液OD595nm值。5.菌液抑制率的计算通过3株端粒酶抑制剂筛选模型菌分别对2000多株放线菌发酵液样品高通量筛选,各个96孔板的筛选结果分别处理,筛选结果用以下公式计算抑制率：抑制率(%)=(溶剂对照孔OD595nm—样品孔OD595nm)/(溶剂对照孔OD595nm-空白对照孔OD595nm)×100%6.复筛初筛实验数据计算抑制率后,对所有抑制率达45%以上的高活性放线菌发酵液样品进行复筛。放线菌发酵液是一种天然药物资源,据文献报道,某些放线菌发酵液有细胞毒性,为排除放线菌发酵液样品对模型酵母菌的生长抑制作用是由于其自身毒性作用,而非通过所使用的筛选模型的机制的可能,本实验在复筛中设立了菌株对照板。复筛以酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2(用YPD酵母培养液培养)为对照,培养条件同模型酵母菌,实验方法及抑制率的计算与初筛相同7.阳性样品对端粒酶活性抑制作用的评价37℃,5%CO210%小牛血清DMEM培养基培养白血病细胞株K562,首先在培养瓶中培养观察细胞,待细胞生长状态稳定后由培养瓶转移细胞至48孔细胞板中,每孔加入10μl阳性放线菌发酵液阳样品并设溶剂对照孔和空白对照孔。每12小时观察细胞状态并与对照孔细胞对比,24小时后收集细胞。结果1.筛选系统的验证经酵母菌液PCR、3-AT抗性分析、β-半乳糖苷酶活性分析等方法验证,结果表明本实验室所保存的3株端粒酶抑制剂筛选模型菌均未出现质粒丢失,都可用于下一步的筛选。2.最佳筛选条件的选择实验结果表明酵母菌起始培养浓度OD595nm为0.04时,酵母菌在48小时内持续生长,未出现平台期,是合适的酵母菌起始培养浓度。在酵母菌液起始浓度OD595nm为0.04时,筛选最佳的放线菌发酵液样品剂量10μl,酒精绝对浓度为2.5%时,对酵母菌生长影响较小。因此,放线菌发酵液样品剂量为10μl,酵母菌起始筛选浓度OD595nm为0.04是最佳筛选条件。3.初筛结果通过对2000多株放线菌发酵液样品高通量筛选和筛选结果的计算对比,将抑制率大于或等于45%的样品定为阳性样品,初筛共筛出21株阳性样品,样品编号分别是：100-05、148-14、133-05、144-03、GD17、59-27、51-27、160-11、51-2、155-20、37-7、157-05、37-5、51-10、58-09、H41-50、11-11、73-8、40-08、GD-17、179-02、72-5、47-12、H120-20、H102-4、GD18、12-01,并用于下一步复筛。4.复筛结果对初筛所筛出的21株放线菌发酵液样品进行复筛。复筛以酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2为对照菌,共得到14株阳性样品,其样品编号为：100-05、148-14、59-27、160-11、51-2、155-20、157-05、37-5、58-09、H41-50、GD-17、H120-20、GD18、12-01。5.阳性样品对端粒酶活性抑制作用的评价白血病K562细胞株与10μl阳性放线菌发酵液样品孵育12小时后,观察细胞生长状态并和溶剂对照孔与空白对照孔对比。阳性样品对细胞的生长有抑制作用,相对于溶剂对照孔,样品孔细胞数量较少,细胞状态差,且培养液中有较多的细胞碎片。K562细胞与阳性样品孵育24小时后,发现相对于溶剂对照孔,样品孔细胞数量明显减少,细胞状态明显较差,且培养液中有大量的细胞碎片。由此我们可以推断,阳性样品有较强的端粒酶活性抑制作用。结论本研究首次运用端粒酶酵母三杂交筛选模型对2000多株放线菌发酵液样品高通量筛选端粒酶抑制剂,方法简便快捷,筛选结果稳定可靠,并筛选到14株放线菌发酵液样品可能具有抗肿瘤活性,为进一步研究和开发抗肿瘤新药奠定了基础。本研究的创新之处1.利用RNA三杂交理论,首次运用人端粒酶的二个核心成分hTERT与hTR是否结合作为唯一变量的端粒酶特异抑制剂高通量筛选模型高通量筛选抗肿瘤药物；2.首次将端粒酶抑制剂的筛选应用到天然产物—放线菌发酵液中,为寻找端粒酶抑制剂开辟了新的途径。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-26
技术路线  26-27
实验仪器与材料  27-31
实验方法  31-42
  第一部分高通量端粒酶抑制剂筛选模型的验证  31-36
  第二部分高通量筛选端粒酶抑制剂  36-39
  第三部分阳性样品的评价  39-42
实验结果  42-50
讨论  50-57
结论  57-58
参考文献  58-66
中英缩写对照表  66-67
硕士期间发表论文  67-68
致谢  68-70
统计学审稿证明  70

放线菌发酵液中端粒酶抑制剂的高通量筛选

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