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水稻抗白叶枯病相关基因的克隆及增强表达载体的构建

作　者: 李美玲
导　师: 陈剑平
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 疣粒野生稻 白叶枯病 抗病基因 同源克隆 基因超表达
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 51次
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内容摘要


水稻是世界重要粮食作物之一。由革兰氏阴性黄单胞菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻生产中最严重的细菌性病害。实践证明利用寄主抗性,培育抗病品种是防治该病最经济、有效和环保的方法。抗病品种的培育在于挖掘和利用新的抗病基因,因此分离和克隆新的抗病基因已成为当今抗病研究的热点。野生稻中蕴藏着丰富的有利基因,尤其是抗病虫基因。疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)对白叶枯病高抗或接近免疫,同时高抗病、虫侵染,而且疣粒野生稻中没有与抗病基因Xa1、Xa21同源的基因,加之独立进化,推断其具有新的优异抗白叶枯病基因,值得深入研究和发掘利用。但是由于生殖隔离、遗传背景知识匮乏及组培再生体系不完善等限制,使传统杂交育种及常用的抗性基因克隆方法都难以在野生稻中利用,而采用同源克隆法来克隆其抗病相关基因是一条有效途径。植物在受到病原菌侵染时,抗病基因与病原菌识别并发生一系列信号转导过程,使植物产生系统获得抗性。在此过程中会有许多转录因子及相关蛋白参与。本研究采用同源序列法,在从疣粒野生稻中克隆了参与系统获得抗性产生的TGA转录因子同源基因(OmTGA1、OmTGA2)、PR蛋白同源基因(OmPR1)及Xα5基因同源基因(Omxa5)的基础上,构建了水稻超表达载体,通过农杆菌介导法转化了水稻品种日本晴(Nipponbare)和石狩白毛(Ishikari palemane),获得了T0代转基因植株。主要实验结果如下：1、根据生物信息学分析及栽培稻已报道序列设计引物,利用RT-PCR,从疣粒野生稻中克隆得到OmTGA1基因、OmTGA2基因、OmPR1基因和Omxa5基因的完整ORF序列,大小分别为993bp、1410bp、486bp和321bp。2、根据已克隆片段序列设计引物采用RACE方法克隆并拼接得到上述4个基因的全长cDNA序列,大小分别为1729bp、1961bp、778bp、842bp,并进行同源性搜索和序列分析。3、构建了含OmTGA1基因的超表达载体pU-OmTGA1、含OmTGA2基因的超表达载体pU-OmTGA2、含OmPR1基因的超表达载体pU-OmPR1和含Omxa5基因的超表达载体pU-Omxa5。4、以日本晴和石狩白毛水稻愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导的方法,将这4个超表达载体分别转化,获得了T0代转基因水稻植株,并进行鉴定。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-11
缩略词表  11-13
第一章 文献综述  13-27
  1 水稻白叶枯病的危害及抗病基因发掘  13-14
    1.1 水稻白叶枯病的危害及防治  13
    1.2 水稻白叶枯病抗病基因的发掘  13-14
  2 植物抗病的分子生物学研究  14-22
    2.1 基因对基因假说  15
    2.2 水杨酸信号转导途径  15-16
    2.3 植物抗病基因  16-19
    2.4 植物抗病基因的克隆  19-21
    2.5 同源序列法在野生稻抗病基因克隆方面的应用  21-22
  3 cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification ofcDNA Ends,RACE)  22-24
    3.1 RACE技术的原理  23
    3.2 RACE技术的评价  23-24
  4 本论文研究目的及意义  24-26
  5 技术路线  26-27
第二章 水稻抗病相关基因的克隆  27-42
  1 前言  27
  2 材料与方法  27-34
    2.1 材料  27-29
    2.2 方法步骤  29-34
  3 实验结果  34-40
    3.1 疣粒野生稻总RNA的提取及cDNA质量检测  34
    3.2 RT-PCR扩增结果  34-35
    3.3 序列测定和分析  35-37
    3.4 cDNA全长序列的克隆及序列分析  37-40
  4 讨论  40-42
第三章 疣粒野生稻xa5基因同源基因克隆及序列分析  42-46
  1 前言  42
  2 材料与方法  42-43
  3 实验结果  43-45
    3.1 RT-PCR扩增结果  43-44
    3.2 水稻Omxa5基因cDNA全长序列的克隆及序列分析  44-45
  4 讨论  45-46
第四章 增强表达载体的构建  46-59
  1 前言  46-47
  2 材料与方法  47-53
    2.1 材料  47
    2.2 方法步骤  47-53
  3 实验结果  53-58
    3.1 农杆菌转化增强表达载体的构建  53-54
    3.2 菌液PCR筛选阳性转化菌落  54-55
    3.3 水稻再生植株的获得  55
    3.4 转基因水稻阳性植株的鉴定  55-58
  4 讨论  58-59
结论  59-61
  1 主要研究结果  59-60
  2 主要创新之处  60
  3 今后研究方向与目标  60-61
参考文献  61-70
附录  70-74
致谢  74-75
攻读学位期间发表的学位论文  75-76

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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