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水稻OsNLR1基因抗白叶枯病的功能研究

作　者: 董瑞仙
导　师: 陈剑平
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻白叶枯病农杆菌介导的转化 NBS-LRR OsNLR1
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

由革兰氏阴性菌黄单胞水稻变种(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)引起的水稻白叶枯病(Bacterial Blight, BB)是水稻中最严重的病害之一。目前,控制该病最有效的方法是抗性基因的筛选及抗病品种的培育。疣粒野生稻(Oryza meyeriana L.)对水稻白叶枯病菌表现为免疫,但是它与普通栽培稻之间存在有性杂交障碍,难以对其抗性基因进行利用。Y73是疣粒野生稻和栽培稻感病品种“大粒香”(Oryza sativa L. ssp. japonica)经不对称体细胞杂交产生的后代,但Y73对白叶枯病菌和农杆菌侵染都具有抗性。为了研究Y73对农杆菌的抗性,我们对Y73和大粒香转基因效率进行了比较分析。为了能够方便对抗病材料Y73中抗性基因的功能进行分析,我们也需要了解Y73对农杆菌的抗性,建立高效的Y73转基因体系。在转基因过程中,我们通过AAM悬浮培养基和共培养温度的优化来尝试提高Y73的转基因效率。研究显示在相同转基因条件下抗病材料Y73的转基因效率(35.7%)显著低于感病材料大粒香(71.2%),表明Y73中可能存在某些与大粒香不同的抗性基因,可以对农杆菌介导的转基因过程产生影响,此抗性可能与白叶枯病抗性相关。通过降低共培养温度和使用AAM3悬浮培养基,我们将Y73的转化效率从29.9%提高到了66.5%,从而建立了高效的Y73转基因体系。我们发现共培养温度对Y73转基因效率的影响较大,低温(20℃)可以减弱Y73对农杆菌的抗性,产生更高的转化效率。为了研究农杆菌侵染过程中Y73的分子机制,我们采用qRT-PCR方法对不同转化条件下Y73中OsMPKs、OsVIP1s和OsPR1s基因表达进行了研究分析。在农杆菌介导的转基因过程中,拟南芥MAPK3蛋白的激活可以使VIP1蛋白磷酸化并定位至植物细胞核内,进而调节PR1基因的表达,而VIP1蛋白同时也参与了农杆菌T-DNA的核输入过程。qRT-PCR研究显示,2个OsVIP1s和几乎所有的OsPR1s基因在20℃农杆菌侵染后的表达水平均高于25℃,而OsMPKs没有显著变化。我们推测在低温条件下诱导产生的OsVIP1与VirE2蛋白相互作用,从而促进农杆菌T-DNA复合物向植物细胞转运,进而导致更高的转化效率。本研究还表明在水稻中存在与拟南芥相似的MAPK/VIP1防御信号路径,参与农杆菌介导的植物转基因过程。在Y73中该信号通路可能受到了温度的调控,进而影响到农杆菌介导的Y73转基因效率。抗性基因在植物抗病过程中发挥着重要的作用,目前很大一部分抗病基因编码产物都具有NBS-LRR结构域,该结构与蛋白质之间的相互作用及抗病信号传导密切相关。本实验室前期基因表达芯片分析结果显示,水稻高抗白叶枯病新品种Y73在接种白叶枯病菌株P10 (PXO124)后,一个NBS-LRR类基因的表达量显著上调,我们采用RT-PCR技术从Y73中克隆了该基因的CDS片段(2631 bp),并将该基因命名为OsNLRl (Rice NBS-LRR Resistance gene 1)。测序结果表明该扩增片段与栽培稻序列一致,我们推测该基因可能受疣粒野生稻中抗病基因的影响并且参与了水稻的抗病过程。为了分析其功能,我们利用pCAMBIA13000双元载体分别构建了OsNLR1基因超表达及干涉载体,并采用农杆菌介导的转基因方法获得了转基因水稻植株。接菌实验显示,抑制OsNLR1基因的表达,能减弱抗病材料Y73的抗性；而提高OsNLR1基因的表达水平,则能增强感病材料的耐病性。这些结果表明OsNLR1基因与水稻白叶枯病抗性直接相关。此外,OsNLR1基因亚细胞定位结果还显示,OsNLR1编码产物主要定位于水稻细胞膜和细胞核,表明该基因很可能与信号转导和下游基因转录密切相关。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-11
缩略词表  11-12
第1章文献综述  12-23
  1.1 植物抗病基因的研究进展  12-17
    1.1.1 PAMPs引发的免疫系统  12-13
    1.1.2 抗病基因介导的免疫反应  13-15
    1.1.3 抗病基因的保守结构及其分类  15-17
  1.2 水稻抗白叶枯病研究  17-19
    1.2.1 水稻白叶枯病菌  17-18
    1.2.2 水稻白叶枯病抗性基因的研究  18-19
  1.3 农杆菌介导的水稻转基因技术  19-21
    1.3.1 水稻转基因技术  19
    1.3.2 农杆菌介导的转化过程及影响因素  19-20
    1.3.3 植物中与农杆菌侵染相关的基因  20-21
  1.4 本研究的目的和意义  21-23
第2章白叶枯病抗性材料Y73的转基因研究  23-38
  2.1 实验材料  23-24
  2.2 实验方法  24-31
    2.2.1 水稻Y73材料RNA提取及反转录  24-26
    2.2.2 根癌农杆菌电击感受态细胞的制备  26-27
    2.2.3 农杆菌介导的水稻转基因过程  27-28
    2.2.4 Y73与大粒香转基因效率比较  28
    2.2.5 Y73转基因体系的优化  28-29
    2.2.6 植物中农杆菌侵染相关基因在不同条件下的表达分析  29-31
    2.2.7 数据统计与分析  31
  2.3 实验结果  31-34
    2.3.1 Y73和大粒香转基因效率比较分析  31-32
    2.3.2 Y73转基因体系的优化  32-33
    2.3.3 Y73中OsMPKs,OsVIP1s和OsPR1s基因在不同温度下的表达差异  33-34
  2.4 分析与讨论  34-38
第3章水稻OsNLR1基因白叶枯病抗性研究  38-50
  3.1 实验材料  38-39
  3.2 实验方法  39-43
    3.2.1 水稻OsNLR1基因的克隆  39-40
    3.2.2 超表达及干涉载体构建  40-41
    3.2.3 转基因苗的生成及阳性鉴定  41-42
    3.2.4 转基因苗的接菌试验  42
    3.2.5 OsNLR1::sGFP融合表达载体构建及转化  42
    3.2.6 水稻OsNLR1基因亚细胞定位观察  42-43
    3.2.7 数据统计与分析  43
  3.3 实验结果  43-48
    3.3.1 水稻OsNLR1基因的克隆及载体构建  43
    3.3.2 水稻转OsNLR1因材料鉴定  43-45
    3.3.3 水稻OsNLR1基因白叶枯病抗性分析  45-46
    3.3.4 水稻OsNLR1基因亚细胞定位  46-48
  3.4 分析与讨论  48-50
第4章结论与展望  50-52
  4.1 主要结论  50-51
  4.2 创新之处  51
  4.3 展望  51-52
参考文献  52-63
附录  63-68
致谢  68-69
攻读学位期间取得的研究成果  69-70

水稻OsNLR1基因抗白叶枯病的功能研究

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