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Real-time RT-PCR检测JEV方法的建立与JEV入侵BHK-21细胞内吞途径的初步研究

作　者: 黄恒
导　师: 曹三杰；文心田
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本乙型脑炎病毒 实时荧光定量RT-PCR 内吞途径
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


流行性乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的严重危害人畜健康的一种虫媒传染病。病毒进入宿主细胞是感染早期的关键环节,病毒和细胞的不同,病毒进入细胞的方式和途径也不同。本研究建立了Real-time RT-PCR检测日本乙型脑炎病毒的方法,并应用该方法对日本乙型脑炎病毒入侵细胞的内吞途径进行了初步研究。1. Real-time RT-PCR检测JEV方法的建立本文根据GenBank登录的JEV (SA14-14-2)序列,设计合成了一对特异性引物,构建了JEV质粒标准品,建立了实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)检测JEV的诊断方法。通过检测10倍系列稀释的JEV标准质粒模板显示,该方法的灵敏度能达到15 copies.对不同浓度的质粒标准品进行组内和组间重复性实验,其变异系数(CV)均小于5%,显示该方法具有良好的重复性；对乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)等病毒进行扩增,结果显示该方法对JEV具有高度特异性。该方法建立的标准曲线为：Y=-0.3007X+10.53,拟合度r2=0.997,PCR循环效率为96.53%；研究结果表明,该方法快速、灵敏度高、特异性强、重复性好且能实时定量检测,可用于JEV分离鉴定、JEV感染疑似病例检测、JEV感染定量检测研究及其分子流行病学调查。2.日本乙型脑炎病毒入侵BHK-21细胞的内吞途径初步研究本试验选用氯丙嗪、制霉素和细胞松弛素D三种药物分别处理细胞,以阻滞网格蛋白介导内吞途径、细胞膜穴样内陷途径和巨胞饮途径,然后进行JEV感染实验,通过Real-time RT-PCR方法测定感染后1 h、12 h、24 h细胞内的病毒拷贝数,结果显示：与仅实施感染实验、未进行药物处理的对照组比较,三个药物处理组的细胞内病毒拷贝数,在感染后各时相点均呈现不同程度的下降,其中氯丙嗪处理组下降最为明显,感染后1 h、12 h、24 h细胞内病毒拷贝数分别下降了59.58%,53.34%,61.35%；而细胞松弛素D和制霉素处理组仅有少量下降。在感染后1 h、12 h和24 h,细胞松弛素D组细胞内病毒拷贝数分别下降了23.59%,30.77%,30.14%；制霉素组细胞内病毒拷贝数分别比对照组下降了35.56%,34.40%,34.40%。试验结果表明：JEV主要利用网格蛋白介导内吞途径进入BHK-21细胞。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略词表  8-10
目录  10-13
文献综述  13-27
  1. 日本乙型脑炎病毒研究进展  13-15
    1.1. 日本乙型脑炎病毒基因组结构  13-14
    1.2. 日本乙型脑炎病毒的主要蛋白  14-15
  2. 病毒入侵细胞内吞途径的研究进展  15-18
    2.1. 病毒入侵细胞的内吞途径  16-17
    2.2. 病毒入侵细胞内吞途径的研究方法  17-18
  3. 实时荧光定量PCR检测方法研究进展  18-26
    3.1. 实时荧光定量PCR的基本原理  18-19
    3.2. 荧光定量PCR的判定方法  19
    3.3. 荧光定量PCR主要分类  19-22
    3.4. 荧光定量PCR主要定量方法  22-23
    3.5. 荧光定量PCR标准品  23-24
    3.6. 荧光定量PCR的应用  24-25
    3.7. 荧光定量PCR的应用前景  25-26
  研究目的与意义  26-27
实验研究  27-54
  第一章 Real-time RT-PCR检测日本乙型脑炎病毒方法的建立  27-45
    1. 实验材料  27-29
      1.1. 菌株与毒株  27
      1.2. 主要试剂  27
      1.3. 试剂配制  27-28
      1.4. 主要仪器设备  28-29
    2. 实验方法  29-36
      2.1. 乙型脑炎病毒增殖  29
      2.2. JEV标准品的制备  29-34
      2.3. 标准品浓度的计算  34
      2.4. Real-time RT-PCR方法的建立与条件优化  34-35
      2.5. 特异性实验  35
      2.6. 灵敏性实验  35
      2.7. 重复性实验  35-36
      2.8. 标准曲线的绘制  36
    3. 结果  36-43
      3.1. JEV病毒E基因的扩增  36
      3.2. JEV E基因的克隆与鉴定  36-37
      3.3. 标准品浓度的计算  37-38
      3.4. 反应条件的优化  38-40
      3.5. 特异性实验  40
      3.6. 灵敏性实验  40-41
      3.7. 重复性实验  41-42
      3.8. 标准曲线的绘制  42-43
    4. 讨论  43-45
      4.1. 日本乙型脑炎病毒的检测方法  43-44
      4.2. Real-time RT-PCR检测JEV方法的建立  44-45
  第二章 日本乙型脑炎病毒内吞途径的初步研究  45-54
    1. 实验材料  45-46
      1.1. 细胞与毒株  45
      1.2. 主要试剂  45
      1.3. 试剂配制  45-46
      1.4. 主要仪器设备  46
    2. 实验方法  46-49
      2.1. 药物工作浓度的测定  46-47
      2.2. 乙脑病毒入侵BHK-21细胞内吞途径分析  47-49
    3. 结果  49-52
      3.1. 药物工作浓度测定  49-50
      3.2. 乙脑病毒内吞途径分析  50-52
    4. 讨论  52-54
      4.1. 药物对细胞毒性检测方法的研究  52-53
      4.2. 药物处理在病毒内吞途径研究中的应用  53
      4.3. 日本乙型脑炎病毒内吞途径的研究  53-54
结论  54-55
参考文献  55-59
致谢  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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