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类球红细菌产辅酶Q_（10）的菌种选育及发酵条件优化

作　者: 任鹏
导　师: 周虹；于群
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 辅酶Q10 Co60诱变发酵条件优化发酵罐中试
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

辅酶Q10(Coenzyme Q10,简写为CoQ10),又称泛醌(Ubiquinone),化学名称为2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基-1,4-苯醌。CoQ10在细胞呼吸链上位于NADH和细胞色素C之间,起传递氢质子的作用,是人体中唯一的辅酶Q类物质。其在各种动植物细胞和细菌中广泛存在,具有抗氧化、抗衰老、清除体内自由基、提高机体免疫力等功能。已经被越来越多的应用于各类心脏病、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的辅助治疗,并在保健品及化妆品领域具有广阔的市场。微生物发酵法是目前生产CoQ10的主要生产方法之一,优良的发酵菌株是微生物发酵法工业化生产CoQ10的前提,而通过发酵条件的优化,进而使菌株最大程度的发挥其发酵能力,是工业生产最经常使用的调控方式之一。由于CoQ10的生物合成途径复杂,涉及超过20种代谢中间产物及调控酶类,现阶段通过基因工程方法改变单一或某几个关键酶基因对发酵菌株的生产能力提高有限。传统物理和化学诱变育种技术仍是CoQ10生产育种的重要手段。本论文采用钴60(Co60)辐照诱变方法结合传统紫外线诱变育种方法对实验室现有菌株进行诱变育种,并利用实验室建立的高通量筛选平台进行筛选,从中筛选出产量较高的突变株作为种源。调整发酵培养基中不同碳氮比并根据CoQ10生物合成和代谢途径选择不同前体物质,正交试验确定前体物质的最优发酵配比,利用发酵罐在线检测筛选菌株的生长状态,以不同时间点CoQ10的产量为指标对优化条件进行验证。本论文共分三个部分:(1)类球红细菌菌株的诱变育种研究;(2)类球红细菌生产CoQ10的发酵条件优化;(3)CoQ10的发酵罐中试规模试验。主要研究结果如下:通过Co60和紫外线诱变实验筛选出较初始菌株类球红细菌Rhodobacer.sphaeroides高产的突变株6株;筛选确定适合的发酵培养基碳源比例;最优发酵前体组合;发酵罐中试放大验证优化条件有效。一、诱变育种试验根据文献调研确定Co60诱变辐照强度为5Gy,致死率达到95%以上,符合诱变要求;利用实验室建立的高通量筛选平台将选出的菌株继续紫外线诱变,最终筛选出较高产量的突变株6株。二、类球红细菌产CoQ10发酵条件优化调整发酵培养基碳源比例,以CoQ10产量为指标最终确定碳源含量。试验了对羟基苯甲酸、维生素B1,乙酸钠、西红柿汁、胡萝卜汁、异戊醇等参与辅酶Q10合成代谢的多种发酵前体,最终正交试验确定发酵前体的最优配比为VB110 mg/L、乙酸钠100 mg/L、对羟基苯甲酸20 mg/L、花生油0.01%。在此条件下CoQ10产量由13.296 mg/L增加到31.824 mg/L,产量提高了139%。三、发酵罐优化条件验证实验利用筛选出的发酵培养基碳氮比例为基础培养条件,pH、溶氧为在线观测指标,不同时间点取样,通过斐林试剂法检测发酵液中总糖含量,确定碳源的动态消耗;考察发酵前体添加与否、添加时机对CoQ10产量的影响;研究不同溶氧条件下突变株的生长状况。结果显示:发酵24h后添加滤过前体CoQ10产量最高,达到129.972 mg/L,较不添加前体时的产量84.252 mg/L增加了42.9%;而发酵前体与碳氮源共灭菌后发酵不能有效提高CoQ10产量,但可以大大缩短CoQ10发酵周期;而筛选出的突变株CU20-9在发酵体系溶解氧减小时CoQ10产量降低,证明实验室筛选出的突变株CU20-9不适合低溶氧培养。

全文目录

英文缩略词表  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-13
第一章类球红细菌菌株的诱变育种研究  13-24
  1. 材料  13-15
  2. 方法  15-19
  3. 结果  19-23
  4. 讨论  23-24
第二章类球红细菌生产辅酶Q10的发酵条件优化  24-37
  1. 材料  24-27
  2. 方法  27-31
  3. 结果  31-36
  4. 讨论  36-37
第三章辅酶Q10的发酵罐中试规模试验  37-50
  1 材料  37-39
  2. 方法  39-42
  3. 结果  42-48
  4. 讨论  48-50
结论  50-51
参考文献  51-55
文献综述  55-61
发表论文  61-69
个人简历  69-70
致谢  70

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