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RAPD及SSR方法对HFJ和MIJ近交系大鼠的遗传特性分析

作　者: 李建辉
导　师: 刘福英；王俊霞
学　校: 河北医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: RAPD 微卫星高繁殖力雄性不育近交系大鼠
分类号: Q95-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 20次
引　用: 1次
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内容摘要

目的:大鼠是药物开发和人类疾病研究最重要的实验动物之一,近交系大鼠更有其不可替代的应用价值。目前,世界上培育成功的近交系大鼠已有1000种左右,但是,我国使用的近交系大鼠全部是从国外引进的。本单位实验动物中心的技术人员从2001年6月开始培育近交系大鼠,从屏障环境饲养的Wistar大鼠中选择雌雄1对,作为起始亲代,连续近亲交配繁殖,初步形成HFJ和MIJ两个不同特点的近交系。初步观察,HFJ品系大鼠繁殖性能和后代发育性能明显高于其他品系大鼠,甚至高于远交群大鼠。经送国家实验动物遗传检测中心检测该品系已经符合近交系动物遗传标准。进一步开发研究,即可建立具有自主知识产权的实验动物新品系。MIJ品系大鼠表现为后代雄性出现小睾丸和生殖系统自发肿瘤,初步观察为常染色体单基因隐性遗传,进一步开发可培育出自发雄性不育和生殖系统肿瘤动物模型,作为人类疾病研究和新药开发的重要实验材料,填补世界自发雄性不育品系大鼠的空白。在近交系动物的繁殖和饲养中由于饲养管理不当和人为失误或动物自身的遗传变异等,造成近交系遗传特征发生改变,出现遗传污染或基因突变,如果不能将变异的大鼠及时剔除,将会影响到整个大鼠群的遗传特性。如果在科学研究中被采用,将会导致实验失败或可靠性降低甚至得出错误的结论。因此,对其进行严格、有效的遗传质量监测,保证其遗传稳定性十分必要。现行哺乳动物遗传质量检测方法中,国家标准仅对生化标记和免疫学标记法做出相应规定,但以上方法检测的都不是遗传物质本身,而外在的表现是基因和环境综合作用的结果,检测结果可能与实际并不完全一致。比如BALB/c小鼠与其突变系BALB/c-nu-nu,用生化标记分析是无法区分这两种动物的。分子生物学检测方法以动物基因组DNA为检测材料,DNA的差异是一种生物与另一种生物的本质区别。因此,分子生物学检测方法不会像以表型为检测材料的传统方法那样受到环境的影响。而且同传统生化标记和免疫学标记相比,具有简便、快捷、敏感等优势。RAPD和SSR是上世纪90年代发展起来的分子生物学研究方法,在目前实验动物遗传研究应用的分子生物学方法中是比较常用的两种,现在已广泛用于遗传作图,动物的品系鉴别,实验动物的遗传多样性及稳定性研究。本实验目的是用RAPD和SSR方法对HFJ和MIJ两个近交系大鼠进行遗传分析,建立两大鼠的RAPD和SSR特征性遗传图谱,作为该品系动物遗传检测的参考。方法:1基因组DNA的提取:用传统酚-氯仿法和自动核酸提取仪提取4个品系HFJ(F23)、MIJ(F21)、F344和Lewis大鼠基因组DNA。2 RAPD技术对四个近交系大鼠进行遗传研究:选择60条随机引物,对HFJ(F23)、MIJ(F21)、Lewis大鼠、F344大鼠基因组扩增,经2%琼脂糖凝胶电泳,检测四个品系的遗传多样性。3 SSR方法对近交系大鼠进行遗传研究:根据大鼠基因组数据库和文献选择24个SSR位点并进行PCR扩增,进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过银染显色照相,比较四个品系大鼠之间的多态性,对HFJ、MIJ大鼠遗传稳定性检测。结果:1 RAPD方法对四个品系的大鼠基因组进行扩增,总共60条引物,其中有12条引物能在四个品系均扩出清晰的条带,用引物C-19扩增,电泳图中可见Lewis大鼠和F344大鼠在1000bp处多出现一条明显的条带,HFJ(F23)和MIJ(F21)大鼠均无此条带;引物M-10扩增中,F344大鼠1000bp处扩增出条带,其他品系大鼠则没有。M-4引物扩增中,仅F344雌性大鼠1000bp处扩增产物出现多态性条带,M-5引物扩增,仅F344雌性大鼠1000bp和小于500bp处扩增出多态性条带,其他大鼠则没有。使用选定的15条引物扩增结果显示,HFJ和MIJ大鼠之间均表现相同的扩增图谱。2四个品系大鼠HFJ、MIJ、Lewis、F344均在24个SSR位点扩增出PCR产物,其中HFJ、MIJ大鼠之间除D6Mit1、D6Mit5、D10wox12引物扩增产物外其他大小无差别;HFJ、MIJ两品系同Lewis和F344近交系分别在11个SSR位点扩增产物大小有差异,其中与Lewis不同的位点包括D1Rat345, D3wox9, D3Wox6, D4Arb10, D5Hmgc2, D7Mit19, D8Rat14, D8Mit7, D11Mgh3, D11Wox3, D12Mit2 ,与F344不同的位点包括D1Rat345, D4Arb10, D5Hmgc2, D7Mgh3, D7Mit19, D8Mit7, D9Mit2, D10Wox12, D10Mgh22, D11Mgh3, D11Wox3;Lewis同F344之间在9个SSR位点扩增产物大小有差异,包括D3Wox9, D3Wox6, D7Mgh3, D8Rat14, D9Mit2, D10Wox12, D10Mgh22, D10Mgh3, D12Mit2。HFJ(F23)在D6Mit1、D10Wox12位点处,出现品系内条带差异,D6Mit1扩增图中HFJ(F23)雄性扩增片段比雌性扩增片段稍大,D10Wox12扩增图中HFJ(F23)雌雄均呈杂合。用11只HFJ(F26)大鼠重复以上实验,扩增图谱的条带均一致,未发现品系内差异。MIJ(F21)在D6Mit5、D10Wox12位点处,出现品系内条带差异,两位点扩增图中MIJ(F21)雌性呈杂合,对重新选取的9只MIJ(F23)雄性大鼠重复以上实验,扩增图中9只MIJ(F23)谱条带一致。结论:1用筛选的12条随机引物建立起HFJ和MIJ近交系大鼠的特征性RAPD图谱,两近交系图谱完全一致,但与Lewis和F344均存在显著的不同。2用24个SSR位点建立起HFJ和MIJ两近交系大鼠的特征性SSR图谱,两近交系非常相似,但与Lewis和F344存在显著差别。实验中曾发现在HFJ和MIJ存在品系内的差异,但是,在以后的重复性实验中未得到验证。3由于HFJ和MIJ共同起源于同一对Wistar大鼠,因此基因组极为相似,而同Lewis和F344存在显著的差异性。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
研究论文 RAPD 及SSR 方法对HFJ 和MIJ 近交系大鼠的遗传特性分析  10-40
  引言  10-12
  第一部分 RAPD 方法对HFJ 和MIJ 近交系大鼠的遗传特性分析  12-24
    前言  12-13
    材料与方法  13-16
    结果  16-17
    附图  17-20
    附表  20-21
    讨论  21-22
    小结  22
    参考文献  22-24
  第二部分 SSR 方法对HFJ 和MIJ 近交系大鼠的遗传特性分析  24-40
    前言  24
    材料与方法  24-29
    结果  29-30
    附图  30-33
    附表  33-36
    讨论  36-37
    小结  37-38
    参考文献  38-40
综述动物遗传检测中应用的分子标记  40-50
致谢  50-51
个人简历  51

RAPD及SSR方法对HFJ和MIJ近交系大鼠的遗传特性分析

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