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耐万古霉素肠球菌分子特性研究

作　者: 李茹
导　师: 吕元；李敏；蒋晓飞
学　校: 复旦大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 耐万古霉素肠球菌 vanX基因 MLST PFGE 基因分型
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肠球菌是革兰阳性球菌,是临床上较常见的一类条件致病菌,它可导致人体多脏器的感染,引起临床感染的主要为粪肠球菌(E. faecalis)和屎肠球菌(E. faecium)。近年来由于抗菌药物的广泛应用,肠球菌引起的医院感染呈逐渐上升趋势,其已成为引起医院感染的第二大病原菌。自上世纪80年代首次分离得到第一株耐万古霉素肠球菌(Vancomycinresistant enterococcus, VRE)以来,糖肽类抗生素耐药肠球菌的数量不断增多,甚至出现了其耐药性向其他细菌转移的严重现象。世界多个国家都相继出现了有关VRE的报道,目前VRE已经成为卫生部门所面临的重要威胁与挑战。目前还没有发现十分有效的治疗VRE的药物,所以耐药菌株的临床治疗相当困难,而且治疗费用较高。一般治疗原则为通过检测病原菌对药物的敏感性,来选择合适的抗感染药物。大量研究表明参考VRE耐药表型对治疗药物选用具有重要的指导意义。本研究通过检测临床分离肠球菌对万古霉素及替考拉宁的MIC,从而了解耐药株的耐药表型,并同时检测万古霉素耐药基因,探讨了肠球菌产生万古霉素耐药性的分子生物学机制,并对筛选到的VRE菌株进行了6种临床常用抗生素的耐药性检测,为临床合理选用抗生素提供依据；同时,对VRE菌株通过PFGE及MLST进行克隆分型,为分子流行病学研究提供有价值的信息,这对于细菌性传染病监测,传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。目的：调查上海华山医院2007-2009年间890株临床肠球菌的VRE分离率,以及耐药菌株的耐药表型,并对筛选到的菌株检测其对临床常用的其他6种抗生素的敏感性,为临床合理应用抗生素提供依据。同时从分子水平上研究耐药株的耐药基因,为同种耐药基因型别菌株的分子流行学研究提供参考依据。方法：收集上海华山医院2007年1月-2009年6月890株肠球菌,采用琼脂平板筛选法(ADSP)筛选耐药菌株,同时按照CLSI推荐的方法以微量肉汤稀释法对筛选出的13株疑似VRE检测其对万古霉素及替考拉宁的MIC。除此以外,我们还采用E-test方法检测了耐药株对临床常用的治疗肠球菌感染的6种抗生素(庆大霉素,氨苄青霉素、利奈唑胺、红霉素,环丙沙星、氯霉素)的敏感性。采用PCR及测序方法检测万古霉素耐药基因(vanA,vanB, vanX)。结果：采用琼脂平板筛选法(ADSP)筛选得到13株疑似VRE,微量肉汤稀释法确证13株疑似VRE均对万古霉素耐药。其中6株(2007-2008)均对万古霉素高度耐药,但对替考拉宁敏感(万古霉素MIC≥64-256 mg/L),耐药基因检测结果提示其均携带同一种可能导致万古霉素耐药的新型基因,该基因序列与现有的已报道的耐药基因均不同(本文中将其暂定为vanX),另外,7株(2009)VRE菌株对万古霉素及替考拉宁均耐药,对万古霉素及替考拉宁的MIC分别为32-64mg/L和16-32 mg/L,耐药基因检测结果提示其均携带vanA耐药基因。讨论：上海华山医院2007年1月-2009年6月间存在对万古霉素及替考拉宁均耐药的VanA型耐药表型,该表型耐药基因容易转移,易在临床中发生耐药性的大范围播散。同时该表型为获得性耐药,提示与抗生素的滥用密切相关,值得引起临床有关部门注意。另一方面,在本研究中我们发现了可能导致万古霉素耐药的新型基因vanX介导的VRE的存在,该新基因的功能和定位尚待进一步研究。目的：为检测耐药流行株是否正在传播,可将分离株进行分子生物学分型,通过分型可以鉴定比较菌株是否一致,对于细菌性传染病监测,传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。同时检测耐药菌株的可能毒力因子的携带情况以及耐药克隆株的生物膜的形成能力方法。方法：采用多位点测序分型方法(MLST)以及脉冲场凝胶电泳(PFGE)对耐药菌株进行克隆分型,同时运用PCR结合测序方法检测耐药菌株的毒力因子esp及hyl基因。另一方面,我们还通过微量滴定板制备生物膜的方法来检测菌株的生物膜形成能力。结果：13株VRE分离株代表4种不同的ST型。其中4株为ST18,6株VRE为ST78,2株为ST341,1株为ST203,11株VRE同属于同一个克隆复合型(ClonalCompleX)CC17。6株由vanX基因介导耐药的VRE的PFGE分型不同,MLST及PFGE分型结果都提示这6株VRE属于不同型别,可见其不是单克隆流行播散。13株VRE毒力基因esp和hyl的阳性率分别为69.2%和30.8%。微量滴定板制备生物膜方法检测菌株的生物膜形成能力结果提示13株VRE不具有生物膜形成能力。结论：13株VRE的MLST及PFGE分型结果提示华山医院的VRE的克隆株均为多克隆流行,且大多数菌株属于同一克隆复合型CC-17,具有一些共同的耐药特征。6株vanX基因型VRE中,虽然esp基因携带率为83.3%,但不具有生物膜形成能力。目的：了解vanX新型万古霉素耐药基因在导致万古霉素耐药的确切作用机制并且对该基因进行定位研究。方法：构建含有VanX基因的重组质粒PRB473-VanX,并将其转化至工具菌saRN4220中,观察受体菌对万古霉素的耐药表型是否发生改变,从而证明该基因在导致万古霉素耐药性的作用。另一方面,我们通过质粒接合实验,并通过PFGE及体外药敏试验来验证耐药株是否通过接合作用将耐药相关基因转移到受体菌中,从而使受体菌由万古霉素敏感株变为万古霉素耐药株。结果：VanX基因转化实验结果尚存有争议,疑似转化成功的克隆株用划线法接种在含有万古霉素的TSB平板上,24h后有菌落生长,但只存在于划线一区,同时阴性对照平板上无菌落生长；在质粒接合实验中,6株由VanX基因介导的VRE菌株为供体菌进行接合试验,结果发现抗生素筛选平板上有一株菌株出现了生长,表示接合转移成功,之后的体外药敏试验也证明受体菌由对万古霉素敏感变为耐药,同时PFGE验证结果发现接合后的菌体的DNA条带信息与受体菌BM-4105RF不同,但是包含有原先的一些DNA信息,说明转移成功。结论：VanX基因与vanA基因的同源性最高,在导致耐药性产生的作用机制也极其相似,VanX基因有可能位于质粒,通过质粒接合作用转移至其他菌种或菌属。另一方面,VanX基因不是产生耐药性的充分条件,其周围序列以及某些蛋白可能在产生耐药性的过程中也发挥着必不可少的作用。对VanX基因的功能和定位,还需要进一步的实验来证实。

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