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应用高分辨率熔解曲线分析技术快速、准确检测TMPRSS6基因突变

作　者: 吴和明
导　师: 徐湘民；李亮
学　校: 南方医科大学
专　业: 医学遗传学
关键词: 高分辨率熔解曲线分析 TMPRSS6基因基因分型基因突变铁不应性缺铁性贫血定点诱变
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的铁是人体内含量最丰富的一种必需元素,存在于所有细胞内。在体内除主要参与血红蛋白的合成和氧的输送外,还参与体内的一些生物化学的过程,包括线粒体的电子传递、儿茶酚胺代谢及DNA的合成。此外,参加三羧酸循环的酶和辅酶约半数含有铁或需要铁的存在。因此,铁代谢平衡被破坏会造成人体多方面功能的紊乱。人体内铁的含量在正常情况下维持在一个狭窄的范围内,铁缺乏和铁过载均会引起相对应的疾病。铁缺乏可以引起缺铁性贫血和儿童神经系统的疾病,铁过载可以引起血色病。铁缺乏在全球范围内超过5亿人,导致最常见的疾病为缺铁性贫血。缺铁性贫血中有一种类型被称为铁不应性缺铁性贫血(iron-refractory iron deficiency anemia, IRIDA),患者特点为先天性小细胞低色素性贫血,平均血红细胞体积低,血清铁和铁传递蛋白饱和度低,经口服铁剂以后血液学指标没有改善,但静脉注射的铁剂治疗有部分效果。有学者发现此病是一种常染色体隐性遗传病,是患者跨膜丝氨酸蛋白酶6(Transmembrane serine protease 6, TMPRSS6或称Matriptase-2)基因突变导致血清中铁调素(hepcidin,或称肝抗菌肽)含量增高所致。跨膜丝氨酸蛋白酶6是一种Ⅱ型细胞膜丝氨酸蛋白酶,最早在2005年被克隆并且定位。有学者认为跨膜丝氨酸蛋白酶6与人体铁代谢平衡密切相关。跨膜丝氨酸蛋白酶6通过控制体内铁调素的水平来调节体内铁的代谢平衡。铁调素是肝脏内产生的一种荷尔蒙,能够调节消化道内铁的吸收和巨噬细胞内铁的释放。铁调素与细胞膜铁释放通道蛋白结合,使其内化并且在溶酶体内被水解,从而阻止消化道细胞和巨噬细胞内铁释放到血清中。人体内铁调素表达增高可以使血清铁含量下降,导致缺铁性贫血；铁调素表达降低则可以使血清铁含量增高,导致体内铁过载。编码跨膜丝氨酸蛋白酶6的TMPRSS6基因是位于22号染色体长臂1区2带的基因。TMPRSS6基因突变导致铁不应性缺铁性贫血的病例在2008年被报道。迄今为止,国外已经有很多TMPRSS6基因突变导致铁不应性缺铁性贫血的报道。同时,一些学者认为TMPRSS6基因与铁过载也有联系。中国人群与其他民族人群遗传背景存在差异,中国人TMPRSS6基因突变的与其他民族之间也可能存在差异。根据PubMed等文献检索数据库的检索结果,未见有关中国人群TMPRSS6基因突变导致缺铁性贫血的报道。据研究,我国儿童铁元素缺乏的病例所占比例较高。高分辨率熔解曲线分析(High-resolution melting, HRM)技术是一种基于PCR的突变检测方法,该方法通过检测DNA双链序列之间的解链差异来判断序列之间的差异。双链DNA分子的解链受一些因素的影响,包括：片段长度、序列的GC含量和GC分布等。当片段在一定条件下,单个碱基的变化对片段的解链温度有影响,通过高分辨率和灵敏度的检测技术可以检测出来。一个纯合子样品经过PCR扩增之后得到的是同源双链,G：C和A：T之间单个碱基的变化的纯合突变对片段的解链温度有影响。杂合子样品经过PCR变性、复性之后,其组分包含四种双链分子：两种同源双链、两种异源双链。PCR之后,PCR产物结合上了染料,开始升温之前PCR的荧光强度很高。逐渐升高温度,随着温度的升高,DNA双链逐渐解开,结合上的染料被释放,荧光值逐渐减少,得到荧光强度随着温度的升高而变化的曲线,即熔解曲线。当片段一定的情况下,单个碱基的差异能反映在解链温度上,表现在熔解曲线的差异。它是一种低成本、高通量、快速、高灵敏度的检测基因突变的方法。本研究主要是通过定点诱变技术与基因克隆技术来构建TMPRSS6基因的已知突变,并针对TMPRSS6基因的所有外显子及剪接位点来设计高分辨率熔解曲线分析检测方法,并用该检测方法筛检中国人群中缺铁性贫血病例以期找到中国人TMPRSS6基因的相关数据。本研究旨在为进一步阐明中国人铁不应性缺铁性贫血的分子机制,为临床上该类疾病的诊断、预防和治疗提供参考,同时也为TMPRSS6基因突变导致的其他铁代谢异常疾病的分子机制的研究提供借鉴。材料与方法1.标本：共收集145例缺铁性贫血病例(男性41例、女性104例；年龄：18.3±14.9岁)的血清及对应的全血标本。采用标准的饱和酚/氯仿法从外周血中提取基因组DNA。2.血液学分析：血常规、血红蛋白含量分析、铁参数指标分析由珠海市妇幼保健医院完成。用“人铁调素hepcidin酶联免疫分析”试剂盒检测血清标本中铁调素(hepcidin)含量。3.分子分析方法：(1)针对国外人群报道的与缺铁性贫血有关的TMPRSS6基因突变采用大引物PCR方法定点诱变和基因克隆方法：首先通过设计定点诱变引物,采用PCR技术直接从人基因组DNA样品中获取目的基因——含某一突变的基因,然后运用经典的基因工程技术将其克隆至pTA2-T载体,转化的宿主菌为大肠杆菌DH5a。每个克隆重组子中插入的目的基因进行DNA测序以验证基因突变型。(2)针对TMPRSS6基因的所有外显子及剪接位点设计高分辨率熔解曲线分析的引物,构建TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲线分析方法。4.统计学分析：用建立的TMPRSS6基因高分辨率熔解曲线分析方法对构建的包含TMPRSS6基因已知突变的人工突变体进行稳定性分析,采用统计学分析方法,以确定该方法的稳定性与可靠性。使用的统计学分析软件为SPSS13.0.5.标本筛检：对所收集的缺铁性贫血标本进行TMPRSS6基因突变筛查。6.实验结果的综合分析、总结。结果运用大引物PCR定点诱变方法人工构建包含TMPRSS6基因已知突变的突变体,并将诱变得到的片段克隆到pTA2T-载体后进行测序,所有克隆均鉴定为所需突变,诱变成功率100%。建立的针对TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲线分析方法能够快速、准确地区分已知突变序列和野生型序列。收集145例缺铁性贫血标本,对其进行血液学分析、检测血清铁调素(hepcidin)含量,共筛选出26例铁调素表达水平高的标本,对这26例标本进行TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲线分析检测,未发现已知突变,亦未发现新突变,只检测到3个已知的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。结论人类营养不良主要以微量元素缺乏为主。人体内铁元素缺乏是当今世界最流行的营养性问题之一,缺铁性贫血是全世界发病率最高的营养性疾病之一。由于体内铁元素不平衡导致的疾病正日益受到关注。高分辨率熔解曲线分析技术是近几年来兴起的基因突变检测技术。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限,无需序列特异性探针,在PCR结束后直接运行高分辨率熔解检测,即可完成对样品基因型的分析。这种方法因其操作简便、快速,使用成本低,结果准确,并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。本课题研究中建立的针对TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲线分析检测方法能够快速、准确地将TMPRSS6基因突变序列与野生型序列区分,并且实验的重复性和再现性好、稳定性高,方法可靠。本研究建立的基于PCR的高分辨率熔解曲线分析TMPRSS6基因突变诊断方法是一种高通量、高灵敏度、自动化、快速、准确、经济的突变检测技术。近年来,TMPRSS6基因突变导致铁不应性缺铁性贫血的病例不断被报道,但并没有对TMPRSS6基因进行人群突变筛查的研究。本研究中,利用高分辨率熔解曲线分析技术对中国人缺铁性贫血病例标本进行突变筛查,没有发现已知突变,这也说明了中国人TMPRSS6基因突变的携带率相对较低。目前,国内对缺铁性贫血的病因分析主要认为是铁摄入的量过少或铁丢失的量过多造成的,较少涉及到遗传学病因的分析。根据PubMed等文献检索数据库的检索结果,未见有关中国人群TMPRSS6基因突变导致缺铁性贫血的报道。因此对缺铁性贫血的遗传学病因的研究具有重要的意义和价值。本研究为TMPRSS6基因的检测建立了一种简便、经济、快速、高效和灵敏的检测方法,这为TMPRSS6基因突变导致的一类疾病的基因诊断和产前诊断提供了一种可选择的工具。本研究对进一步阐明中国人铁不应性缺铁性贫血的分子机制,对临床上该病的诊断、预防和治疗具有重要的参考价值,同时也为TMPRSS6基因突变导致的其他铁代谢异常疾病的分子机制的分析提供了借鉴。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
第1章引言  16-26
第2章实验材料  26-31
  2.1 实验仪器及分析软件  26-27
  2.2 实验试剂  27-30
    2.2.1 外周血基因组DNA提取试剂  27-28
    2.2.2 常规PCR试剂  28
    2.2.3 电泳试剂  28-29
    2.2.4 PCR产物纯化、基因克隆、细菌培养与质粒抽提试剂  29
    2.2.5 铁调素定量检测试剂盒  29-30
    2.2.6 高分辨率熔解曲线分析试剂  30
  2.3 血清样品及DNA样品  30-31
第3章实验方法  31-51
  3.1 技术路线图  31-32
  3.2 人工构建已知突变、克隆  32-42
    3.2.1 引物设计、PCR扩增、产物纯化  32-38
    3.2.2 基因克隆  38-41
    3.2.3 质粒DNA的小量制备  41-42
  3.3 高分辨率熔解曲线分析方法的建立和评价  42-47
    3.3.1 高分辨率熔解曲线分析方法的建立  42-46
    3.3.2 TMPRSS6基因高分辨率熔解曲线分析方法的评价  46-47
  3.4 样本处理与基因检测  47-50
    3.4.1 标本hepcidin含量测定  47-49
    3.4.2 样品基因组DNA的提取及浓度测定  49-50
  3.5 高分辨率熔解曲线分析方法检测标本  50
  3.6 结果分析  50-51
第4章实验结果  51-63
  4.1 大引物PCR定点诱变结果  51-52
  4.2 高分辨率熔解曲线分析方法  52-53
  4.3 高分辨率熔解曲线分析方法检测已知突变的结果  53-58
  4.4 高分辨率熔解曲线分析方法稳定性的统计学分析结果  58-60
  4.5 标本初筛与高分辨率熔解曲线分析检测结果  60-63
第5章分析与讨论  63-68
第6章结论  68-69
第7章参考文献  69-74
附录  74-88
  附录一 pTA2-T载体序列信息  74-78
  附录二稳定性实验原始数据  78-80
  附录三病例表型资料  80-84
  附录四病例血清铁调素ELISA定量结果  84-87
  附录五 26例血清铁调素高表达的标本外周血基因组DNA浓度  87-88
附图  88-94
统计合格证明  94-95
英文缩略词表  95-97
攻读硕士期间所发表论文  97-98
致谢  98-99

应用高分辨率熔解曲线分析技术快速、准确检测TMPRSS6基因突变

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